陳祖祥 葛彥志 范夢強(qiáng) 嚴(yán)莉 嚴(yán)波 單樂天,3 童培建*

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科，杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053；3.杭州市第九人民醫(yī)院骨科，杭州 311225)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,huc-MSCs）可促進(jìn)受損組織再生[1]，近年來已成為再生醫(yī)學(xué)中極具吸引力的治療工具。但是研究發(fā)現(xiàn)只有少量的移植細(xì)胞能夠到達(dá)靶組織且早期凋亡率極高[2-4]。調(diào)髓中藥是治療髓病的主要藥物，且多數(shù)以補(bǔ)益肝腎為主[5]。有多項研究表明調(diào)髓中藥可以調(diào)控MSCs的增殖活力與分化潛力[6,7]。有研究通過對歷代治髓方劑中的調(diào)髓中藥進(jìn)行頻次統(tǒng)計，將調(diào)髓中藥分為不同頻次[5]。本研究擬比較不同頻次調(diào)髓中藥對huc-MSCs的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

α-MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，胰蛋白酶（0.25%）購自美國Thermo Fisher 公司，TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara 公司，2×SYBR購于美國BImake 公司，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）購自中國CellMax 公司，CCK-8試劑盒購于美國BImake 公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購自德國Eppendorf 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司，肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)與何首烏配方顆粒購自中國華潤三九公司。

1.2 Huc-MSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

本研究經(jīng)杭州市第九人民醫(yī)院倫理委員會審批。人臍帶組織取自杭州市第九人民醫(yī)院，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后，采集產(chǎn)婦產(chǎn)后廢棄的臍帶組織，4 h內(nèi)處理，臍帶切成＜2 cm3體積，用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffer saline,PBS）洗滌3次。去除表皮組織和血管內(nèi)皮后，將組織浸入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，在37℃和5%二氧化碳下孵育。培養(yǎng)基每2 d或3 d更換一次。將分離的細(xì)胞作為huc-MSCs收集并重懸于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代。取第二代huc-MSCs，用PBS重懸細(xì)胞，密度為1×106/ml，并分別與CD34、CD73、CD90、CD105等抗體一起孵育。在室溫下孵育30 min后，將每個細(xì)胞懸浮液以2000 r/min（r=14 cm）離心5 min。取出上清液，加入100 μl PBS，將細(xì)胞沉淀重懸，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將培養(yǎng)至第三代的huc-MSCs以4×103/孔的密度接種于96 孔板上，每孔200 μl α-MEM 培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h。將肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)和何首烏配方顆粒用不含F(xiàn)BS的α-MEM 培養(yǎng)基以10、50、100、200、400、600、800、1000 μg/ml 的濃度進(jìn)行稀釋。移除huc-MSCs培養(yǎng)基，加入稀釋后的不同濃度的含6種藥物的α-MEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 后，移除所有培養(yǎng)基，每孔加入200 μl 10%的CCK-8 溶液，并在37℃孵育2 h，直到顏色變成橙色，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔在450 nm 處的吸光度（optical density,OD）值，重復(fù)操作3次。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗

取對數(shù)生長期的huc-MSCs 接種在6 孔板（3×105/孔）中，將細(xì)胞分為對照組、肉蓯蓉組、川芎組3 組。細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%之后，用10 μl 槍頭垂直于培養(yǎng)皿底部水平劃痕，PBS 清洗細(xì)胞2次，洗去劃下的細(xì)胞。對照組加入不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基，肉蓯蓉組、川芎組分別加入含1000 μg/ml肉蓯蓉、川芎的α-MEM 培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡下于3 個不同的時間點（0 h、12 h 和24 h）對細(xì)胞進(jìn)行觀察和拍照。劃痕面積用Image J 1.47 軟件計算。每個實驗重復(fù)3 次。劃痕愈合率=（0 h 劃痕面積－12 h/24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.5 Transwell遷移實驗

在帶有Transwell小室（孔徑8 μm）的24孔板中進(jìn)行Transwell遷移實驗。收集對數(shù)生長期的huc-MSCs，用PBS 洗滌，并以2×105/ml 的密度重懸于無FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞分為對照組、肉蓯蓉組、川芎組3 組，然后將200 μl 的huc-MSCs 懸液裝入Transwell的上腔室，對照組在下腔室加入600 μl的無FBS的α-MEM培養(yǎng)基，肉蓯蓉組、川芎組在下腔室分別加入600 μl的含1000 μg/ml肉蓯蓉、川芎的α-MEM培養(yǎng)基。37℃孵育24 h后，取出小室清洗，通過上腔室膜的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，并用0.1%的結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS清洗3遍，重復(fù)實驗3次，用顯微鏡對不同區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行拍照、計數(shù)。

1.6 qPCR檢測huc-MSCs相關(guān)mRNA的表達(dá)

將培養(yǎng)至第3代的huc-MSCs分為對照組、肉蓯蓉組、川芎組3組。對照組用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，肉蓯蓉組、川芎組分別用含1000 μg/ml 肉蓯蓉、川芎的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后加入TRIzol 試劑，再加入氯仿（TRIzol 試劑體積的1/5）劇烈振蕩，再靜置5 min，以12 000×g離心15 min，取上清液并加入等量異丙醇，混勻后靜置10 min，再以12 000×g離心10 min。去上清，再加入乙醇（75%）清洗，干燥沉淀后，加入RNase-free水溶解，提取總RNA。使用All-in-one cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒 檢測CDC25A、CCNA2、E2F1、E2F2、MMP-2、TWIST1、VITMENTIN、PCNAmRNA 表達(dá)，目標(biāo)基因序列見表1，各基因mRNA表達(dá)量用2-ΔΔCt計算結(jié)果來表示。

表1 qPCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均符合正態(tài)分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 huc-MSCs鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，huc-MSCs 低表達(dá)CD34，高表達(dá)CD73、CD90、CD105，陽性率均高于90%，見圖1。這表明本研究分離培養(yǎng)的huc-MSCs具有較高的純度。

圖1 huc-MSCs鑒定結(jié)果

2.2 不同濃度不同頻次調(diào)髓中藥對huc-MSCs 活力的影響

huc-MSCs經(jīng)處理24 h后，不同濃度的肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸均能顯著增強(qiáng)huc-MSCs活力，其中肉蓯蓉的促增殖作用最強(qiáng)。較低濃度的川芎、白術(shù)、何首烏對huc-MSCs具有促增殖作用，但是隨著濃度的增加，它們的促增殖作用一直在降低，在1000 μg/ml時，川芎不利于huc-MSCs 增殖，表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性。從400 μg/ml 濃度開始，高頻調(diào)髓中藥肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸的促增殖作用大于低頻調(diào)髓藥物川芎、白術(shù)、何首烏，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或0.01，表2）。后續(xù)實驗選用兩組藥物中相對具有代表性的肉蓯蓉和川芎進(jìn)行實驗，并且均采用1000 μg/ml的濃度。

表2 不同濃度不同頻次調(diào)髓中藥對huc-MSCs活力的影響（n=3，，OD450）

表2 不同濃度不同頻次調(diào)髓中藥對huc-MSCs活力的影響（n=3，，OD450）

注：△P＜0.05，▲P＜0.01，與肉桂組、肉蓯蓉組、當(dāng)歸組比較

2.3 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，在處理12 h、24 h 后，肉蓯蓉組劃痕兩側(cè)細(xì)胞密度逐漸增大，空白面積逐漸減少，劃痕愈合率均增加，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或0.01），尤其是24 h 時，肉蓯蓉組的劃痕幾乎全部消失；而處理12 h、24 h后，川芎組劃痕愈合率均較對照組降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

Transwell 實驗結(jié)果顯示，處理24 h 后，肉蓯蓉組細(xì)胞遷移數(shù)量、細(xì)胞遷移率均較對照組增加，但是川芎組細(xì)胞遷移數(shù)量、細(xì)胞遷移率均較對照組降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、圖3和表3。

表3 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs遷移能力的影響（n=3，）

表3 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs遷移能力的影響（n=3，）

注：aP＜0.05，bP＜0.01，與對照組比較

圖2 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs遷移能力影響的劃痕實驗結(jié)果

圖3 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs遷移能力影響的transwell遷移實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色）

2.4 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

qPCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，處理24 h 后，肉蓯蓉 組huc-MSCsCDC25A、CCNA2、E2F1、E2F2、MMP-2、TWIST1、VITMENTIN、PCNA的mRNA表達(dá)量均增加，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或0.01）；川芎組huc-MSCsE2F1、E2F2、MMP-2的mRNA表達(dá)量均降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意 義（P＜0.05 或0.01），而CDC25A、CCNA2、TWIST1、VITMENTIN、PCNA的mRNA 表達(dá)量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs相關(guān)mRNA表達(dá)量的影響（）

表4 肉蓯蓉和川芎對huc-MSCs相關(guān)mRNA表達(dá)量的影響（）

注：△P＜0.05，▲P＜0.01，與對照組比較

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一類具有高度的自我更新與多向分化能力的細(xì)胞[8]，可以從骨髓、脂肪、臍帶等多種組織中分離出來[9,10]，在人體生長、發(fā)育和生殖過程中起始動作用[11]，在臨床上具有十分廣闊的應(yīng)用前景。huc-MSCs與其他來源的MSCs 相比具有數(shù)量多、擴(kuò)增能力強(qiáng)、強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力等特點[12]，而且由于它具有較低的免疫原性，因此成為同種異體移植的更好的候選物[13,14]。但是大部分的臨床療效仍不理想，這主要是因為MSCs 移植到體內(nèi)后存活率很低，并且還很難歸巢到靶組織[15]。因此，當(dāng)前有大量研究都將重點放在如何增強(qiáng)MSCs的療效上[16]。自體血清干細(xì)胞（platelet rich plasma,PRP）中加入激活劑使PRP釋放細(xì)胞內(nèi)的多種生物活性分子[17,18]，能夠促進(jìn)MSCs 增殖、遷移等[19-22]。血小板裂解物含有豐富的生長因子，也能夠促進(jìn)MSCs 增殖、遷移、分化等[23]，并且聯(lián)合應(yīng)用血小板裂解物和huc-MSCs可以明顯加強(qiáng)huc-MSCs治療骨關(guān)節(jié)炎的療效[24]。

傳統(tǒng)中草藥作為我國巨大的寶藏，具有巨大的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥能夠增強(qiáng)MSCs 功能。梅花鹿骨骼和甜瓜籽提取物鹿瓜多肽能夠促進(jìn)huc-MSCs增殖、遷移以及抗炎因子肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）、前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）和腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6（tumor necrosis factor-α inducible protein 6，TSG6）的分泌[25]。丹參提取物丹參酮Ⅱa 能夠增強(qiáng)huc-MSCs遷移、歸巢、再生修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)特性[26]。調(diào)髓中藥作為治療髓病的主要藥物，對于MSCs 具有調(diào)控作用，它們不僅可以促進(jìn)MSCs 增殖，抑制其凋亡，也可以促進(jìn)骨髓MSCs分化[27,28]。

本研究的目的在于比較不同頻次調(diào)髓中藥對huc-MSCs的作用。首先本課題組選用了肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸3味高頻調(diào)髓中藥和川芎、白術(shù)、何首烏3味低頻調(diào)髓中藥進(jìn)行細(xì)胞活力測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂、肉蓯蓉、當(dāng)歸可以顯著促進(jìn)huc-MSCs 增殖，然而川芎、白術(shù)和何首烏的促增殖作用隨著濃度的增加逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)到1000 μg/ml 時，川芎對huc-MSCs 增殖具有抑制作用，并且從400 μg/ml 濃度開始，高頻調(diào)髓中藥的促增殖作用明顯高于低頻調(diào)髓藥物。后續(xù)實驗中本課題組選用了兩種頻次調(diào)髓中藥中具有代表性的肉蓯蓉和川芎。雖然細(xì)胞增殖能力決定了最終可分化為靶細(xì)胞的MSCs 數(shù)量，但是MSCs 遷移能力決定了MSCs 歸巢到靶組織的數(shù)量[29]。因此本研究進(jìn)行了細(xì)胞劃痕和Transwell 遷移實驗，結(jié)果表明肉蓯蓉可以促進(jìn)huc-MSCs 遷移，而川芎抑制huc-MSCs 遷移。進(jìn)一步的qPCR結(jié)果顯示肉蓯蓉對huc-MSCs 的作用主要與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因（CDC25A、CCNA2、E2F1、E2F2）[30]和細(xì)胞遷移相關(guān)基因（MMP-2、TWIST1、VITMENTIN）[31]以及與細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA[32]有關(guān)；而川芎對huc-MSCs 的作用主要與E2F1、E2F2、MMP-2有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同頻次的調(diào)髓中藥在體外對于huc-MSCs 的作用不同。高頻調(diào)髓中藥對huc-MSCs的促增殖能力高于低頻調(diào)髓中藥，并且高頻調(diào)髓中藥可以促進(jìn)huc-MSCs 遷移，而低頻調(diào)髓中藥抑制huc-MSCs 遷移。這些體外研究結(jié)果提示在體內(nèi)不同頻次的調(diào)髓中藥可能對于huc-MSCs 也具有不同的作用。因此本課題組下一步研究將會探討不同頻次調(diào)髓中藥在體內(nèi)對于huc-MSCs 的作用。此外，本研究選取的藥物有限，需要進(jìn)一步擴(kuò)大不同頻次的調(diào)髓中藥進(jìn)行實驗驗證。