于麗麗，馬 瑞，馬 堅，郭飛行，胡 晨，董 文，阮文彥，遲丹丹，黃永清

唇腭裂(CLP)為人類最為常見的一種先天性發(fā)育畸形，在世界的發(fā)病率為1/500～1/1 000[1]。根據(jù)其是否伴有其他先天性出生缺陷，可將唇腭裂分為綜合征型唇腭裂(SCL/P)和非綜合征型唇腭裂(NSCL/P)[2]。NSCL/P是其中較常見的一類，包括單純唇裂(CL)、唇裂伴腭裂(CLP)以及單純腭裂(CP)。因種族、地區(qū)、社會經(jīng)濟狀況、環(huán)境暴露因素以及基因的不同而呈現(xiàn)差異性。 本課題組在前期研究中，利用全基因組外顯子捕獲測序方法，對NSCL/P遺傳17個大家系樣本進行易感基因篩查，在其中一個家系中發(fā)現(xiàn)受體絡(luò)氨酸激酶A3(EPHA3，EPH Receptor A3)基因的點突變可能與非綜合征型唇腭裂的發(fā)病相關(guān)。EPH分為EPHA和EPHB 2個亞型。有報道研究發(fā)現(xiàn)，EPHB與顱額鼻綜合征(CFNS)有關(guān)，CFNS綜合征可表現(xiàn)為唇裂、上顎及鼻部發(fā)育不全與顱面不對稱的臨床表現(xiàn)[3]?；贓PHB與唇腭裂的關(guān)系，推測EPHA有可能與CLP也存在相關(guān)性。本研究選取該基因上常見的88個SNP，基于病例-對照研究,以期驗證EPHA3基因多態(tài)性與NSCL/P之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2013年1月-2019年12月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔頜面外科的唇腭裂患兒血樣504例,其中男302例，女202例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒患先天性非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(NSCL±P)，不伴有其他系統(tǒng)器官的先天性疾病，患兒家庭無其他遺傳病家族史、家庭至少三代為寧夏籍。對照樣本DNA來源于同期寧夏地區(qū)寧夏籍健康新生兒臍帶血，共455例,其中男214例，女241例。樣本采集均征得患者或其監(jiān)護人知情同意，并簽署知情同意書，研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審批通過后進行。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取：采集受試者外周靜脈血5 mL，經(jīng)EDTA抗凝。采用Wizard基因組DNA純化試劑盒(美國普洛麥格Promega公司)提取純化基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳，采用微量紫外分光光度計(美國/Equl-Thermo SCIENTIFIC)對樣本DNA進行濃度及純度的檢測。

1.2.2 基因位點選?。翰樵僋CBI的SNP數(shù)據(jù)庫，選取EPHA3基因上MAF>0.05的88個SNP進行研究。

1.2.3 基因分型：基因分型基于Ion Torrent測序平臺，運用AgriSeqTM靶向測序技術(shù)。準(zhǔn)備10 ng DNA，在單一PCR反應(yīng)中擴增多個SNP靶標(biāo)，局部消化引物序列，清洗準(zhǔn)備模板制備，自動化構(gòu)建AgriSeqTM文庫，模板制備和芯片上樣，測序及基因分型。該過程于北京博奧生物有限公司進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：用Haploview軟件對對照組的所有位點進行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗，P>0.05為符合H-W平衡。對等位基因頻數(shù)進行χ2檢驗，并計算等位基因頻數(shù)的比值比(OR)及95%可信區(qū)間( 95%CI)。如OR<1，且95%CI區(qū)間上限<1，說明該等位基因可能為NSCL/P的保護因素；如OR=1，說明該等位基因與NSCL/P無關(guān)；如OR>1，且95%CI區(qū)間下限>1，說明該等位基因可能是NSCL/P的危險因素。用SPSS統(tǒng)計軟件對基因型頻數(shù)進行χ2檢驗，對所有SNP位點進行連鎖及單倍型分析[4],以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H-W平衡檢驗：經(jīng)過H-W平衡檢驗，對照組樣本中rs7637670、rs9866959、rs7619025、rs7644070、rs7646842、rs9873281的6個SNP位點不符合H-W平衡(P<0.05)，其余位點均符合H-W平衡(P>0.05)，對符合H-W平衡的位點進行下一步分析。

2.2 等位基因頻數(shù)和基因型頻數(shù)比較分析：經(jīng)過H-W平衡檢驗，篩選出EPHA3基因上的8個符合H-W平衡且等位基因頻數(shù)在病例組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的SNP位點，其中rs907713OR=0.624,95%CI為0475～0.819，可能為保護因素。篩選出7個SNPs可能均為危險因素，見表1。對這7個位點的基因型進行進一步分析，其中病例組與對照組中rs7428598和rs79843236的基因型頻數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1-表2。

表1 2組等位基因頻數(shù)的比較

表2 2組基因型頻數(shù)的比較

位點基因型病例組(n=504)對照組(n=455)χ2值P值rs7429534 CC1461185.198>0.05 TC265226 TT90108rs9868686 CC851035.456>0.05 CT255223 TT162128rs78776790 CC774.717>0.05 CT117133 TT379313 rs79843236 AA147.168<0.05 AG6784 GG435366rs34986288 AA13145.252>0.05 AG142157 GG346279

2.3 連鎖及單倍型分析：連鎖分析后得到了7個單體型塊，其中共2個單體型塊中的4個單體型在病例組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。單體型塊 1中的單體型TA(P<0.05)，單體型塊3中的單體型CTTACATGCTGCGTCGAAGCCTCTATTT(P<0.05);CTGCGCCTTGGTCTAGTGTATCGAGCATACC(P<00.5)和單體型CTGCGTATTAACTGAATGCGTAGGGCGCGCC(P>0.05)，組成單體型塊(Block)的SNP，見圖1(目錄后)。

表3 2組單體型塊與單體型頻數(shù)的比較

單體型塊單體型頻率單體型頻數(shù)病例組對照組χ2值P值單體型塊3 ACGTGCCGCAGCTTGACATGCATGGCGTACT#0.35366.8:607.5287.2:579.04.036<0.05 ACGTGCCGTAGCTTGACATGCATGACGTACT0.135120.8:853.5131.6:734.63.037>0.05 CTGCGCCTTGGTCTAGTGTATCGAGCATACC#0.08164.9:909.385.9:780.36.464<0.05 CTGCGTATTAACTGAATGCGTAGGGCGCGCC#0.07890.8:883.553.9:812.36.055<0.05 ACATGCCGTAGCTTGACATGCATGACGTATT0.06766.3:908.058.3:807.90.004>0.05 ACGTTCCGCAGCTTGACATGCATGGCGTACT0.06657.5:916.765.3:800.91.958>0.05 CTGCGCCTTGGTCTAGTGTGTCGAGCATACC0.0549.1:925.245.1:821.10.026>0.05 CTGTGCCTTGGTTTAATGTGTCGAGTATACC0.0548.0:926.345.0:821.20.069>0.05 CCGTGCCGCAGCTTGACATGCATGGCGTACT0.03134.2:940.123.0:843.21.114>0.05 CTGCGTATTAGCTGAATGCGTAGGGCGCGCC0.02118.0:956.320.7:845.50.65>0.05 ACGTGCCGTAGCTTGACATGCATGGCGTACT0.01919.1:955.215.9:850.30.042>0.05 CTGCGCCTTGGTCTGACATGCATGACGTACT0.01110.0:964.310.0:856.20.070>0.05單體型塊4 CGCT0.631635.6:370.4570.6:335.40.008>0.05 AACC0.278279.0:727.0253.0:653.00.009>0.05 CGTT0.08184.3:921.770.3:835.70.246>0.05單體型塊5 AGACCGT0.485495.9:502.1422.7:473.31.195>0.05 GGACCGT0.175164.0:834.0168.0:728.01.753>0.05 AGGTCGA0.117125.0:873.096.0:800.01.502>0.05 AAACTGT0.113101.8:896.2111.9:784.12.472>0.05 AAACTTT0.07777.0:921.068.4:827.60.005>0.05 AGACTGT0.02828.2:969.825.0:871.00.003>0.05單體型塊6 GG0.751751.0:255.0687.7:222.30.217>0.05 AA0.126135.0:871.0106.0:804.01.363>0.05 AG0.123120.0:886.0116.3:793.70.319>0.05單體型塊7 GGTGGC0.806808.9:195.1731.0:175.00.004>0.05 GACGGC0.07982.0:922.068.0:838.00.288>0.05 AGCTAT0.07374.0:930.066.0:840.00.005>0.05 GGCGGC0.03935.0:969.039.0:867.00.847>0.05

3 討論

隨著新一代高通量測序技術(shù)(NGS)的迅速發(fā)展、測序費用降低和時間縮短，對人群遺傳疾病的研究采用全基因組外顯子測序成為熱點的研究方法。外顯子組在人類全基因組中占1%，其含有蛋白質(zhì)合成需要的關(guān)鍵信息，使外顯子區(qū)域的變異能夠較好體現(xiàn)個體表型相關(guān)的多數(shù)功能變異。酪氨酸蛋白激酶受體(RTKs)是能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和遷移能力的Ⅰ型跨膜糖蛋白。EPH受體是受體酪氨酸激酶中最大的家族，可分為EphA和EphB 2個亞類[5]。Eph受體最初被認(rèn)為是軸突引導(dǎo)的中介，參與了許多過程，特別是癌癥的發(fā)展和進展[6]。EPHA3基因?qū)儆诘鞍桌野彼峒っ讣易宓腅ph受體亞家族，位于人類染色體3p11.1。相關(guān)受體參與細(xì)胞調(diào)節(jié)發(fā)育，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中，在生長發(fā)育時期可通過細(xì)胞黏附、運動和收縮調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向與形態(tài)發(fā)生變化[7]。酪氨酸激酶的Eph受體家族及其ephrin配體可通過“反向信號”——即ephrin作為受體，Eph作為配體—它們也可以在黏附中發(fā)揮作用[8]。編碼EFNB1的基因突變可導(dǎo)致顱額鼻綜合征(CFNS)，其表型包括CL/P[9-10]。EFNB1/小鼠存在CP[11]，同源受體EphB2和EphB3的雙突變體也存在CP[12]。多項研究表明，ephrin-B1的反向信號功能對MEE黏附至關(guān)重要。此外，小鼠上顎培養(yǎng)中的EphB反向信號可以挽救轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β3抑制引起的腭裂缺陷[13]。目前，國內(nèi)外學(xué)者均發(fā)現(xiàn)， EPHA3與唇腭裂具有相關(guān)性，郭思遠(yuǎn)等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，EPHA3 基因rs7650466可以導(dǎo)致唇裂的發(fā)生，而與單純腭裂發(fā)病無明顯相關(guān)性[14]。有人等也證明了其與CL/P的相關(guān)性，動物實驗表明，EPHA3表現(xiàn)在第一、第二鰓弓和其在次腭突中高度表達(dá)，因此，認(rèn)為EPHA3是CLP的候選基因[15]。本研究未篩選出rs7632427位點，可能因不同種族及人群的差異性所致。

本研究通過對寧夏地區(qū)17個遺傳大家系進行全基因組外顯子捕獲測序，篩選出997個突變SNP，其中EPHA3位于一個大家系中。本次研究選取該基因上常見的88個SNP，基于病例-對照研究，驗證EPHA3基因多態(tài)性與NSCL/P的相關(guān)性。經(jīng)過H-W平衡檢驗、連鎖及單倍型分析，篩選出EPHA3 基因rs7428598和rs79843236的等位基因頻數(shù)(P<0.05)和基因型頻數(shù)(P<0.05)在病例組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。連鎖分析后得到了7個單體型塊，其中共2個單體型塊中的4個單體型在病例組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，分別為：單體型塊 1中的單體型TA(P<0.05)，單體型塊 3中的單體型CTTACATGCTGCGTCGAAGCCTCTATTT(P<0.05);CTGCGCCTTGGTCTAGTGTATCGAGCATACC(P<0.05)和單體型CTGCGTATTAACTGAATGCGTAGGGCGCGCC(P>0.05)。

本研究通過對EPHA3的等位基因頻數(shù)進行分析，篩選出7個SNPs等位基因頻數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中rs7428598和rs79843236基因位點與NSCL/P存在較強的相關(guān)性。本研究基于特定人群的小樣本，還需要進一步進行大樣本及功能驗證，以確定EPHA3基因其與NSCL/P的相關(guān)性。