劉 青，張 蕾，張利元，王世鳳，左立旻*

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院 1.急診科； 2.呼吸科； 3.檢驗(yàn)科； 4.病理科， 四川 成都 611731)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae，Sp)仍然是引起下呼吸道感染的最常見細(xì)菌病原體，并且是全世界感染性疾病發(fā)病率和病死率的主要原因，尤其是在兒童和老年人中[1]。肺泡上皮細(xì)胞是覆蓋在肺泡上層具有屏障保護(hù)作用的細(xì)胞，眾所周知，Sp感染引起的肺泡上皮細(xì)胞凋亡是肺組織損傷的基礎(chǔ)[2]。因此，闡明肺泡上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制對(duì)尋找有效的肺炎治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一類由外顯子反向剪切形成的共價(jià)封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA分子，其通過與miRNA或RNA集合蛋白作用調(diào)節(jié)細(xì)胞中多種基因的表達(dá)參與包括肺炎在內(nèi)的許多人類疾病進(jìn)展[3]。有研究指出，在脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷中circ_0038467表達(dá)增加，circ_0038467敲低顯著抑制細(xì)胞凋亡并降低促炎因子產(chǎn)生，是肺炎潛在治療靶點(diǎn)[4]。miR-182是一種炎性相關(guān)miRNA，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型肺組織和支氣管肺泡灌洗液中miR-182表達(dá)降低[5]。然而circ_0038467和miR-182在，Sp誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用并不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡的作用細(xì)胞器，外界有害刺激持續(xù)存在可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。本研究主要探討了circ_0038467、miR-182對(duì)，Sp導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞系(HPAEpiC)凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，分析了circ_0038467對(duì)miR-182的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺泡上皮細(xì)胞系(HPAEpiC)和肺炎鏈球菌(Sp)R6(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心)；circ_0038467小干擾RNA、miR-182模擬物(mimics)、miR-182抑制物(anti-miR-182)、circ_0038467過表達(dá)載體以及各自對(duì)照和雙熒光素酶載體(廣州銳博公司)；Trizol試劑、miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green PCR master mix(北京天根生化公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗、兔源重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BIP)多克隆抗體、鼠源CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)單克隆抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)單克隆抗體、兔源Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)單克隆抗體、裂解的caspase-3(cleaved-caspase-3)單克隆抗體和兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用DMEM培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)培養(yǎng)HPAEpiC細(xì)胞，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%培養(yǎng)HPAEpiC。細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。將對(duì)數(shù)期HPAEpiC細(xì)胞接種6孔板，細(xì)胞單層增殖至90%匯合時(shí)用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌R6培養(yǎng)細(xì)胞記為SP組[7]。正常對(duì)照(NC)組為正常培養(yǎng)的HPAEpiC細(xì)胞。Sp+si-NC組、Sp+si-circ_0038467組、Sp+miR-NC組、Sp+miR-182組、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC組、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182組為在用Sp感染前48 h分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0038467、miR-NC、miR-182 mimics、si-circ_0038467+anti-miR-NC、si-circ_0038467+ anti-miR-182至HPAEpiC細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000使用說明進(jìn)行。

1.2.2 RT-qPCR檢測circ_0038467和miR-182表達(dá)：Trizol試劑提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green PCR master mix以GAPDH為內(nèi)參檢測circ_0038467表達(dá)量。使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miScript SYBR Green試劑盒以U6為內(nèi)參檢測miR-182表達(dá)量。2-ΔΔCt法表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：circ_0038467上游5′-TCCCAGCTG ACCTAAAGTCAAT-3′，下游5′-TGGTGACATTGAGC AGGAAC-3′；GAPDH上游5′-GTCAGCCGCATCTTC TTTTG-3′，下游5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；miR-182上游5′-TTTTAGAGGTTTCGTTAATTTTTT C-3′，下游5′-CTCGATTCGAACCTAAACTCG-3′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGAT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTT-3′。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：每組取5×105個(gè)HPAEpiC細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL的FITC-annexin V孵育細(xì)胞10 min，再加入與5 μL的PI暗室內(nèi)孵育細(xì)胞15 min。隨后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.4 蛋白印跡法(Western blot)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：RIPA法提取HPAEpiC細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸法測定總蛋白含量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量變性蛋白，隨后用脫脂牛奶封閉膜后，用1∶1 000稀釋的BIP、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3抗體分別孵育膜2 h，再用山羊抗兔二抗孵育膜1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，ImageJ軟件掃描分析吸光度值。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：合成含有miR-182結(jié)合位點(diǎn)的野生型或突變型circ_0038467序列，將其插入pmir-GLO構(gòu)建成野生型(WT)或突變型(MUT)circ_0038467雙熒光素酶載體，該步驟由上海吉瑪制藥公司完成。用Lipofectamine 2000將WT/MUT-circ_0038467分別與miR-182 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后測定熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值表示。同時(shí)將pcDNA-NC、pcDNA-circ_0038467、si-NC、si-circ_0038467分別轉(zhuǎn)染HPAEpiC細(xì)胞，RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染48 h后miR-182表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌感染對(duì)HPAEpiC細(xì)胞中circ_0038467和miR-182表達(dá)的影響

與NC組比較，Sp組HPAEpiC細(xì)胞中circ_0038467表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，而miR-182表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 Sp感染對(duì)HPAEpiC細(xì)胞中circ_0038467和miR-182表達(dá)的影響

2.2 抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與NC組比較，Sp組HPAEpiC細(xì)胞circ_0038467表達(dá)量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與Sp+si-NC組比較，Sp+si-circ_0038467組HPAEpiC細(xì)胞circ_0038467表達(dá)量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達(dá)量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(表2,圖1～3)。

圖1 抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptosis induced by Sp

圖2 抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig 2 Effect of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptotic proteins induced by Sp

圖3 抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的影響Fig 3 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

表2 抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

2.3 Circ_0038467靶向調(diào)控miR-182的表達(dá)

生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測顯示，circ_0038467與miR-182存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析circ_0038467和miR-182靶向關(guān)系顯示，野生型載體WT-circ_0038467細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中miR-182組細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組顯著降低(P<0.05)(表3)。pcDNA-circ_0038467組細(xì)胞中circ_0038467表達(dá)量顯著高于pcDNA-NC組(P<0.05)，miR-182表達(dá)量顯著低于pcDNA-NC組(P<0.05)；si-circ_0038467組細(xì)胞中circ_0038467表達(dá)量顯著低于si-NC組(P<0.05)，miR-182表達(dá)量顯著高于si-NC組(P<0.05)(表4)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)Table 3 Dual-luciferase reporter

表4 Circ_0038467調(diào)控miR-182的表達(dá)

圖4 Circ_0038467序列中有miR-182結(jié)合序列Fig 4 There was a binding sequence of miR-182 in the circ_0038467 sequence

2.4 轉(zhuǎn)染miR-182對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與Sp+miR-NC組比較，Sp+miR-182組HPAEpiC細(xì)胞miR-182表達(dá)量顯著升高，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達(dá)量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(表5,圖5～7)。

表5 轉(zhuǎn)染miR-182對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

圖5 轉(zhuǎn)染miR-182對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響Fig 5 Effect of transfection miR-182 on apoptosis of HPAEpiC cell induced by Sp

2.5 干擾miR-182表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞炎凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC組比較，Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182組HPAEpiC細(xì)胞miR-182表達(dá)量顯著降低，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(表6,圖8～10)。

表6 干擾miR-182表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

3 討論

CircRNA是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，其異常表達(dá)在肺相關(guān)疾病、腫瘤中具有重要作用。肺癌組織中hsa_circ_100395表達(dá)水平與臨床病理分期、轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[8]。Hsa_circ_0044226高表達(dá)參與肺纖維化進(jìn)展[9]。本研究發(fā)現(xiàn)Sp感染后circ_0038467表達(dá)量顯著增加，提示circ_0038467可能與肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞損傷相關(guān)。功能缺失實(shí)驗(yàn)顯示，抑制circ_0038467表達(dá)顯著減弱Sp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl家族蛋白是細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵因子，制circ_0038467顯著增加HPAEpiC中Bcl-2表達(dá)、降低Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3表達(dá)，與抗凋亡作用吻合。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊和組裝，當(dāng)嚴(yán)重或有害刺激持續(xù)時(shí)間過長時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊和輸出受到干擾，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。本研究中抑制circ_0038467顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物BIP和CHOP蛋白水平。這些結(jié)果表明抑制circ_0038467表達(dá)能夠降低Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖6 轉(zhuǎn)染miR-182對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig 6 Effect of transfection miR-182 on apoptotic proteins of HPAEpiC cell induced by Sp

圖7 轉(zhuǎn)染miR-182對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的影響Fig 7 Effect of transfection miR-182 on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

Bax表達(dá)增加移位線粒體可改變膜通透性，導(dǎo)致促凋亡蛋白釋放，進(jìn)而觸發(fā)caspase-3蛋白激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過降低Bax表達(dá)、增加Bcl-2表達(dá)可減弱脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡[10]。本研究中抑miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，其通過與靶mRNA結(jié)合抑制其表達(dá)在細(xì)胞存活、凋亡、炎性反應(yīng)中發(fā)揮功能。大量研究表明，circRNA通過與miRNA結(jié)合進(jìn)而在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用[12-13]。本研究證實(shí)miR-182是circ_0038467的下游靶點(diǎn)，且circ_0038467負(fù)調(diào)控miR-182表達(dá)。miR-182在多種器官組織的炎性損傷中發(fā)揮作用。骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞治療顯著提高LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型中miR-182表達(dá)水平[14]。miR-182通過抑制Toll樣受體4還可降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中促炎因子產(chǎn)生，改善肝臟缺血再灌注損傷[15]。Sp感染后HPAEpiC中miR-182表達(dá)量顯著降低，提示miR-182可能對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。功能獲得實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-182 mimics顯著降低Sp感染后HPAEpiC細(xì)胞凋亡率，降低Bax、BIP和CHOP蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)。此外，抑制miR-182表達(dá)顯著減弱circ_0038467抑制對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用。

圖8 干擾miR-182表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡的影響Fig 8 Effect of interference with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptosis of HPAEpiC cell inflammation induced by Sp

圖9 干擾miR-182表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig 9 Effect of interfering with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptotic proteins in HPAEpiC cell inflam- mation induced by Sp

圖10 干擾miR-182表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0038467表達(dá)對(duì)Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的影響Fig 10 Effect of interference with miR-182 expression and reverse inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

總之，本研究證實(shí)抑制circ_0038467通過靶向調(diào)控miR-182表達(dá)可減弱Sp誘導(dǎo)的HPAEpiC細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，靶向circ_0038467/miR-182可能成為肺炎治療的重要策略。