高宏宇，張國英，劉秋菊，王 曄，張 莉，陳 超

(1.保定市第二醫(yī)院 腎病科，河北 保定 071051； 2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 保定 071000)

腎病綜合征(nephrotic syndrome)是一種常見的慢性腎臟疾病，是引起腎功能衰竭的主要原因，膜性腎病是腎病綜合征的主要病理類型[1]。研究顯示，脂質(zhì)代謝異常、炎性反應(yīng)、免疫功能紊亂等是引起腎病綜合征發(fā)病的主要原因，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明了[2]。目前，臨床上多使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑進(jìn)行治療，但其副作用大，部分患者易產(chǎn)生激素依賴和抵抗，治療效果較差，因此尋找新的高效治療藥物對(duì)疾病治療具有重要意義。腎臟纖維化是慢性腎臟疾病轉(zhuǎn)變?yōu)槟I衰竭中重要的病理損傷過程[3]，研究顯示，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)屬于受體酪氨酸激酶蛋白家族，與其配體結(jié)合后可以誘導(dǎo)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)，參與調(diào)節(jié)腎纖維化過程[4]。沙利度胺(thalidomide)是谷氨酸衍生物，具有抗炎、抗纖維化等作用，對(duì)肺間質(zhì)纖維化具有顯著的臨床治療效果，可以有效改善患者的肺功能[5]，然而關(guān)于沙利度胺在腎病綜合征中研究報(bào)道較少，本研究通過觀察沙利度胺對(duì)膜性腎病小鼠的影響，初步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性昆明小鼠，8周齡，體質(zhì)量20 g左右，北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為SYXK(京)2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)十周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。批準(zhǔn)文號(hào)(BDEYDS00029)

1.1.2 試劑：沙利度胺(thalidomide)(南通飛宇生物科技有限公司)；來氟米特(leflunomide)(百靈威科技有限公司)；白介素8(IL-8)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技公司)；PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa公司)；Masson染色試劑盒(飛凈生物科技有限公司)；兔源多克隆EGFR抗體、p-EGFR抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、GAPDH抗體和山羊抗兔IgG高度交叉吸附二級(jí)抗體(賽默飛世爾科技有限公司)；蘇木精染液、伊紅染液和PAS染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組參考文獻(xiàn)[6]制備膜性腎病小鼠模型、沙利度胺組(灌胃給予沙利度胺溶液100 mg/kg)、來氟米特組(灌胃給予來氟米特溶液5 mg/kg)，每組15只。

1.2.2 24 h-Upro(24-hour urine protein)的檢測：分別于造模前、造模后、及末次給藥24 h后，將各組小鼠置于代謝籠中，禁食、不禁水，收集24 h尿液，記錄尿量后采用生化自動(dòng)檢測儀檢測24 h-Upro。

1.2.3 各組小鼠血清中生化指標(biāo)及血清中炎性因子的檢測：末次給藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，采腹主動(dòng)脈血10 mL，離心取血清，一部分用全自動(dòng)生化分析儀檢測各組小鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)含量。一部分用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒分別檢測IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平，具體操作步驟參考其說明書。

1.2.4 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)的觀察：取血后，分離腎臟組織，取1.0 g組織存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中備用，剩余組織用4%多聚甲醛固定，制備常規(guī)石蠟切片，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、馬松(Masson)染色、高碘酸-無色品紅(PAS)染色。HE和PAS染色觀察評(píng)估腎結(jié)構(gòu)損傷、Masson染色觀察腎臟纖維化程度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測腎臟組織中EGFR、ERK mRNA表達(dá)水平：取0.5 g腎臟組織提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA，以其為模板，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，48個(gè)循環(huán)，引物序列(表1)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算EGFR、ERK相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠腎臟組織中EGFR、ERK蛋白表達(dá)：取0.5 g各組小鼠腎臟組織提取蛋白，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(抗EGFR、ERK、p-EGFR、p-ERK、GAPDH抗體，1∶1 000)4 ℃過夜，次日加二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，用GAPDH作內(nèi)參，掃描膠片，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 沙利度胺對(duì)小鼠24 h-Upro的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠24 h-Upro顯著升高(P<0.05)。治療4周后，與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠24 h-Upro顯著降低(P<0.05)。(表2)。

表2 沙利度胺對(duì)小鼠24 h-Upro的影響

2.2 沙利度胺對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr含量顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 沙利度胺對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of thalidomide on biochemical indexes of

2.3 沙利度胺對(duì)小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 沙利度胺對(duì)小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的影響

2.3 沙利度胺對(duì)小鼠腎臟組織病理變化的影響

HE染色觀察腎小管上皮細(xì)胞的損傷和腎間質(zhì)水腫情況，HE染色后細(xì)胞核、細(xì)胞內(nèi)核糖體呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整、腎小管上皮細(xì)胞排列整齊無明顯病理變化；與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎小球細(xì)胞排列紊亂，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠上述病理癥狀明顯減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠腎臟組織HE染色Fig 1 HE staining of kidney tissue in each group (scale bar=100 μm)

PAS染色可觀察腎小球內(nèi)的細(xì)胞增生、浸潤和系膜基質(zhì)等情況，PAS糖原顆粒呈紫紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色，其他呈淡粉紅色。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腎小球細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無增生、浸潤等病理變化；與正常對(duì)照組相比模型組小鼠腎小球細(xì)胞增大、系膜增生；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠上述病理癥狀明顯減輕(圖2)。

圖2 各組小鼠腎臟組織PAS染色Fig 2 PAS staining of kidney tissue of mice in each group (scale bar=100 μm)

Masson染色觀察腎小球基底膜、免疫復(fù)合物及膠原纖維等情況，Masson染色后纖維化腎間質(zhì)和未纖維化的腎間質(zhì)、膠原纖維藍(lán)色，胞質(zhì)和肌纖維呈紅色。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腎小球基底膜結(jié)構(gòu)完整、間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積較少，纖維化程度低；與對(duì)照組相比模型組小鼠腎小球基底膜和間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積明顯增多，組織纖維化程度高；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠腎小球基底膜和間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積明顯減少(圖3)。

圖3 各組小鼠腎臟組織Masson染色Fig 3 Masson staining of kidney tissue in each group (scale bar=100 μm)

2.4 沙利度胺對(duì)小鼠腎臟組織中EGFR、ERK mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟組織中EGFR、ERK mRNA水平及p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，來氟米特組、沙利度胺組小鼠腎臟組織中EGFR、ERK mRNA水平及p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4,表5)。

表5 沙利度胺對(duì)小鼠腎臟組織中EGFR、ERK mRNA及蛋白表達(dá)的影響

A.control group；B.model group；C.leflunomide group；D.thalidomide group圖4 各組小鼠腎臟組織EGFR、ERK蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of EGFR and ERK protein in kidney tissue of mice in each group

3 討論

膜性腎病其主要臨床病理特征為全身腫脹、高血脂、有大量蛋白尿[7]。造模后小鼠腎小球體積增大，病變腎小管上皮細(xì)胞有嗜復(fù)紅蛋白沉積，腎小管中有空泡性病伴有炎性細(xì)胞浸潤，24 h-Upro、血清中TC、TG、BUN、Scr含量升高，與報(bào)道[6]一致，提示膜性腎病小鼠模型構(gòu)建成功，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)血脂異常、炎性反應(yīng)和腎臟纖維化。膜性腎病在環(huán)境、遺傳等多種因素作用下，其患病率逐年增加[8]。因此，尋找對(duì)膜性腎病有積極治療作用的方法和藥物，對(duì)其臨床應(yīng)用具有一定科研價(jià)值。研究顯示，沙利度胺聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可以有效治療膜性腎病且副作用輕微[9]。沙利度胺可抑制糖尿病腎病的炎性反應(yīng)和纖維化過程。本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以有效緩解膜性腎病小鼠體內(nèi)血脂異常和炎性反應(yīng)，抑制腎臟纖維化。

腎臟纖維化是膜性腎病重要的病理過程，腎纖維化是由慢性炎性導(dǎo)致的，炎性是炎性因子和細(xì)胞因子通過上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化刺激細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度積累，導(dǎo)致腎纖維化[10]。膜性腎病小鼠血清中IL-2、TNF-α含量升高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組，相比模型組小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)升高，提示膜性腎病引起機(jī)體炎性反應(yīng)。沙利度胺可減少血液中TNF-α含量，對(duì)腎臟有保護(hù)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以抑制炎性因子分泌，減輕小鼠機(jī)體炎性反應(yīng)。

EGFR的增強(qiáng)激活與腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，EGFR的激活導(dǎo)致ERK1/2的磷酸化，從而導(dǎo)致纖維化途徑的激活，EGFR是調(diào)節(jié)腎纖維化的潛在治療靶點(diǎn)[13]。膜性腎病小鼠體內(nèi)ERK1/2磷酸化水平升高[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR、ERK磷酸化蛋白表達(dá)與腎組織纖維化有關(guān)。通過阻斷EGFR抑制Akt和ERK 1/2信號(hào)通路，可以防止腎切除的小鼠腎纖維化，對(duì)其腎臟有保護(hù)作用。另外，沙利度胺可以抑制EGFR、ERK mRNA及磷酸化蛋白水平表達(dá)，推測沙利度胺可能通過抑制EGFR/ERK信號(hào)通路激活，減輕機(jī)體炎性反應(yīng)，緩解腎臟損傷。

綜上所述，沙利度胺可能通過抑制EGFR/ERK信號(hào)通路，緩解機(jī)體炎性反應(yīng)，抑制腎臟纖維化，對(duì)腎臟損傷有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。