武愛(ài)龍，潘浩漢，吳建陽(yáng)，卜 浩

(1.湛江幼兒師范專(zhuān)科學(xué)校， 廣東 湛江 524037；2.嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院， 廣東 湛江 524037)

銀葉金合歡Acaciapodalyriifolia屬豆科含羞草亞科植物，國(guó)內(nèi)早期又叫珍珠相思、真珠相思、昆士蘭銀條等，原產(chǎn)澳大利亞[1]。該樹(shù)適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，樹(shù)形優(yōu)美，花繁葉茂，花朵金黃色，花期長(zhǎng)，葉片呈銀綠色，同時(shí)銀葉金合歡可用于景觀(guān)造型，觀(guān)葉、觀(guān)花效果都非常好，是園藝園林綠化的優(yōu)良樹(shù)種，具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。因此，銀葉金合歡廣泛應(yīng)用于華南地區(qū)城市綠化和生態(tài)景觀(guān)林中[2]。

銀葉金合歡優(yōu)良的種苗主要來(lái)自進(jìn)口，成本昂貴。目前，銀葉金合歡主要采用播種、扦插、壓條、嫁接、分株等方法進(jìn)行繁殖，但效果不理想。國(guó)內(nèi)關(guān)于銀葉金合歡的繁殖主要是通過(guò)播種繁殖[3-7]，但是其種皮結(jié)構(gòu)致密，且種子外部具有蠟狀角質(zhì)層，透氣性透水性極差，不經(jīng)處理的種子發(fā)芽率很低。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有增殖系數(shù)大、生產(chǎn)周期短、可以常年生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn), 因此組培技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種植物種苗的快速繁殖，但是有關(guān)銀葉金合歡的組培快繁研究不是很多，只有李蕊萍等[6-7]對(duì)銀葉金合歡做過(guò)初步的組培研究，方法比較傳統(tǒng)。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，可以減少試驗(yàn)次數(shù)，使用方便，回歸預(yù)測(cè)性好[8]，已在植物組織培養(yǎng)研究中廣泛應(yīng)用[9-10]。本研究采用組培所需的基本培養(yǎng)基MS、激素(6-BA、IBA、GA3、NAA)為培養(yǎng)基原料，并基于單因素的預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用響應(yīng)面法將各因素的相互關(guān)系進(jìn)行擬合分析，研究各因素與響應(yīng)值的關(guān)系，從而優(yōu)化銀葉金合歡的組培條件，以期為今后相關(guān)研究提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

銀葉金合歡采自于湛江東盟城的東菊公園。2018年1月，選擇連續(xù)晴天3 d以上，挑生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株切取當(dāng)年生含腋芽枝條作為誘導(dǎo)材料。

1.2 材料預(yù)處理

先用酒精消毒后的手術(shù)刀將含有腋芽的當(dāng)年枝條，從其母株上切下，切除枝條上的葉部結(jié)構(gòu)后，用流水沖洗干凈，放室內(nèi)晾3 d。隨后，將其放入5%洗潔精溶液中浸泡30 min，軟毛刷洗凈后流水沖洗30 min，切成長(zhǎng)1.0～2.0 cm帶腋芽的莖段，在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精消毒1 min，再用0.2% 升汞(加幾滴吐溫-20)浸泡消毒20 min，最后用無(wú)菌水沖洗5～7次備用。

1.3 接種

將消毒洗凈后的帶腋芽莖段放在無(wú)菌超凈臺(tái)上1 h，等帶腋芽莖段表面水分晾干后，切去帶腋芽莖段兩端壞死部分，最后將帶腋芽莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每次接種每種處理10瓶，每瓶接種1株，3次重復(fù)，所用培養(yǎng)瓶直徑6.6 cm，高度9.5 cm，容量為240 mL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-expert 8.0.5進(jìn)行中心組合試驗(yàn)(Central Composite Design,CCD)設(shè)計(jì)，對(duì)影響銀葉金合歡莖段誘導(dǎo)出不定芽培養(yǎng)基激素濃度配比進(jìn)行研究,以獲得不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基?；谇捌趩我蛩仡A(yù)試驗(yàn),得知影響銀葉金合歡莖段誘導(dǎo)不定芽誘導(dǎo)率的激素有6-BA、IBA、GA3。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方案,以6-BA、IBA、GA33種激素的濃度為三因素，以誘導(dǎo)率為響應(yīng)值(表1)，共17個(gè)處理。將步驟1.3所選取的帶腋芽莖段外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無(wú)菌的帶腋芽莖段接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每個(gè)處理接種30瓶,每瓶接種1個(gè)莖段,光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度為2 000 lx。培養(yǎng)30 d后觀(guān)察記錄發(fā)芽個(gè)數(shù),并計(jì)算各誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率，探討最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表1 銀葉金合歡不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.4.2增殖培養(yǎng) 本試驗(yàn)在前期單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 得知增殖培養(yǎng)3種激素6-BA、IBA、GA3有效的濃度范圍分別為0.2～0.8 mg·L-1、0.2～1.0 mg·L-1、0.1～0.3 mg·L-1。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以增殖系數(shù)為響應(yīng)值(表2),確定增殖培養(yǎng)中激素組合的最佳配比，共17個(gè)處理。將誘導(dǎo)培養(yǎng)所得的不定芽分成單株，轉(zhuǎn)接至含有不同的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。每個(gè)試驗(yàn)接種30瓶,每瓶1個(gè)不定芽,培養(yǎng)30 d后觀(guān)察記錄不定芽的增殖情況,探討最佳的增殖培養(yǎng)基。

表2 銀葉金合歡增殖培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.4.3生根培養(yǎng) 本試驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,得到銀葉金合歡生根培養(yǎng)2種激素IBA、NAA有效濃度范圍分別為0.4～0.8 mg·L-1、0～0.2 mg·L-1,通過(guò)CCD中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以生根率為響應(yīng)值(表3)，確定生根培養(yǎng)中激素組合的最佳配比,共13個(gè)處理。將增殖培養(yǎng)所得的2～3 cm高的無(wú)根芽苗分成單株,接種生根培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10瓶,每瓶2個(gè)外植體，重復(fù)3次；培養(yǎng)40 d后觀(guān)察記錄生根情況，并計(jì)算各生根培養(yǎng)基中生根率。

表3 銀葉金合歡生根培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.5 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)以及增殖基本培養(yǎng)基都是MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度均為30 g·L-1，而生根基本培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為15 g·L-1，培養(yǎng)基瓊脂粉濃度均為6 g·L-1，pH 5.8～6.2。培養(yǎng)溫度26℃左右，光照強(qiáng)度2 000 lx左右,光照時(shí)間12 h·d-1。

1.6煉苗移栽 移栽前將生根瓶苗放在室溫25～30℃的環(huán)境下不開(kāi)蓋煉苗7 d，在移栽前1 d洗凈根部的培養(yǎng)基之后用多菌靈或者高錳酸鉀進(jìn)行浸泡2 min消毒，隨后移栽到消毒好的基質(zhì)中，基質(zhì)配置比例為黃心土∶沙(2∶1)，澆透水，再用薄膜覆蓋保濕保溫，并用遮陰網(wǎng)遮陰。20 d后，揭開(kāi)薄膜進(jìn)行常規(guī)水肥管理。經(jīng)30 d的常規(guī)養(yǎng)護(hù)，即可成活。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,推測(cè)出最佳組合配方并進(jìn)行實(shí)際試驗(yàn)驗(yàn)證。

誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出不定芽的瓶數(shù)/接種瓶數(shù))×100;

增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種總芽數(shù);

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種總苗數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素組合對(duì)銀葉金合歡不定芽誘導(dǎo)的影響

外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基10～15 d后莖段腋芽開(kāi)始逐漸膨大，出現(xiàn)不定芽。部分莖段基部出現(xiàn)褐色分泌物，30 d開(kāi)始統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。從表4可知，17組組合都可以誘導(dǎo)出不定芽，但不同組合的誘導(dǎo)率存在很大的差異，誘導(dǎo)率的范圍在13.56%～62.14%，其中第13組組合誘導(dǎo)率最高(6-BA濃度為2.0 mg·L-1,IBA濃度為0.6 mg·L-1,GA3濃度為0.2 mg·L-1)，達(dá)到62.14%，第5組組合(6-BA濃度為1.0 mg·L-1，IBA濃度為0.2 mg·L-1，GA3濃度為0.2 mg·L-1)誘導(dǎo)率最低13.56%，兩者相差高達(dá)48.58%。通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，第5組也能夠形成大量的愈傷組織，可能原因在于6-BA以及IBA濃度較高有利于誘導(dǎo)不定芽，而GA3濃度較高有利于能夠產(chǎn)生愈傷組織。

2.1.1誘導(dǎo)率回歸方程分析 以培養(yǎng)基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)為自變量因素，莖段誘導(dǎo)出芽的誘導(dǎo)率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(表4)得到回歸方程為:Y=57.40+10.01A+1.33B-0.59-6.68×B-0.33A×C-2.73B×C-15.56A2-10.40B2-7.23C2,其中,相關(guān)系數(shù)R2=0.946 9,校正決定系數(shù)R2=0.878 7。該回歸方程的P值=0.001 1<0.01,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗(yàn)分析得F=0.355 55,P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。表5顯示,A、A2、B2達(dá)到差異極顯著(P<0.01),AB、C2達(dá)到差異顯著(P<0.05)。表明激素6-BA濃度對(duì)銀葉金合歡外植體莖段誘導(dǎo)出不定芽有著極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對(duì)誘導(dǎo)出不定芽差異顯著，IBA濃度與GA3濃度的交互作用對(duì)結(jié)果差異不顯著。通過(guò)回歸方程得到最優(yōu)誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基中6-BA、IBA和GA3濃度分別為A=3.00 mg·L-1，B=0.35 (mg·L-1)，C=0.20 mg·L-1。

表4 不定芽誘導(dǎo)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

2.1.2響應(yīng)值和等高線(xiàn)分析 通過(guò)擬合方程繪制因素間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖,6-BA、IBA和GA3濃度對(duì)銀葉金合歡誘導(dǎo)不定芽影響。由圖1可知,6-BA和6-BA以及6-BA和IBA的交互作用顯著,6-BA和IBA交互作用較小。其中，6-BA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響最大，其次是IBA濃度，對(duì)植株再生頻率影響最小的是GA3濃度。因此,可知銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)不定芽對(duì)培養(yǎng)基中6-BA的濃度變化較為敏感，而對(duì)IBA和GA3的敏感性次之,其敏感性大小為6-BA>IBA>GA3。

圖1 6-BA、IBA和GA3濃度對(duì)銀葉金合歡誘導(dǎo)不定芽影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

2.1.3最佳激素濃度配比及驗(yàn)證 通過(guò)二次回歸方程的分析可得出銀葉金合歡誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最優(yōu)條件為A=3.00 mg·L-1,B=0.35 mg·L-1,C=0.20 mg·L-1，最佳誘導(dǎo)率預(yù)測(cè)值為62.89%。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的有效性,本試驗(yàn)研究了模型推測(cè)出的銀葉金合歡莖段芽誘導(dǎo)最佳激素配比為MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3,該組合下銀葉金合歡莖段的理論出芽率為62.89%。經(jīng)實(shí)際試驗(yàn)觀(guān)測(cè),該組合的平均出芽率為62.35%,與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異，證明響應(yīng)面法可以有效優(yōu)化銀葉金合歡誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其試驗(yàn)方案具有實(shí)際意義和可行性。

2.2 激素組合對(duì)銀葉金合歡莖段增殖系數(shù)及生長(zhǎng)情況

從表6可知，15個(gè)不同組合增殖系數(shù)為1.82～3.69，其中第15組組合(6-BA0.8 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系數(shù)最高，達(dá)到3.69；第4組組合(6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系數(shù)最低，為1.82，2個(gè)組合相差1.87。通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，添加IBA 0.3 mg·L-1,隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)6-BA為0.8 mg·L-1時(shí)，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較慢，呈現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；而GA3濃度上升的情況下，不利于不定芽的誘導(dǎo)分化。

表6 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1增殖系數(shù)回歸方程分析 以培養(yǎng)基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)為自變量因素，增殖系數(shù)(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(表4)得到回歸方程為:Y=2.59+0.43A+0.28B-0.41C+0.22A×B-0.48×A×C-0.085×B×C-0.25×A2-0.050×B2+0.044×C2,其中,相關(guān)系數(shù)R2=0.987 4,校正決定系數(shù)R2=0.971 3。該回歸方程的P值<0.000 1,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗(yàn)分析得F=0.404 2，P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。從表7可知，A、B、C、AB、AC、A2回歸系數(shù)極顯著(P<0.01)。表明激素6-BA、IBA、GA3濃度對(duì)銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)出不定芽差異極顯著，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對(duì)誘導(dǎo)出不定芽差異顯著，但是IBA濃度與GA3濃度的交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著。通過(guò)回歸方程得到最優(yōu)增殖培養(yǎng)基的激素濃度6-BA、IBA和GA3分別為A=0.66 mg·L-1，B=0.45 mg·L-1，C=0.11 mg·L-1。

表7 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

2.2.2莖段增殖響應(yīng)面和等高線(xiàn) 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件繪制因素間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖。由圖2可知, 6-BA、IBA、GA3的交互作用顯著。因此,推測(cè)銀葉金合歡增殖對(duì)培養(yǎng)基中6-BA、IBA、GA3的濃度變化都比較敏感，尤其是6-BA在培養(yǎng)基中的濃度變化對(duì)銀葉金合歡莖段的增殖倍數(shù)影響更明顯。

圖2 6-BA、IBA和GA3濃度對(duì)銀葉金合歡增殖影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

2.2.3最佳激素濃度配比及驗(yàn)證 為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的有效性,本試驗(yàn)對(duì)模型推測(cè)出的最佳激素配比MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),該組合配比下銀葉金合歡莖段理論增殖倍數(shù)為3.785 74。經(jīng)實(shí)際試驗(yàn)可得到平均增殖系數(shù)為3.68,與預(yù)測(cè)值基本一致, 比原17個(gè)組合中最高增殖倍數(shù)高0.10，說(shuō)明方程與真實(shí)試驗(yàn)擬合度較好，證實(shí)了該模型的有效性。

2.3 激素組合對(duì)銀葉金合歡莖段生根率的影響

將增殖培養(yǎng)后, 將高為2～3 cm的叢生芽苗切割為單個(gè)植株接入到不同的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。由表6可知,13組組合都可以誘導(dǎo)出不定根，但不同組合的生根率有所不同，各組合生根率為43.31%～81.68%，其中第8組組合(IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最高，達(dá)到61.68%，第7組組合(IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最低，為23.31%；兩個(gè)處理組合相差37.37%。通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA、NAA激素濃度較低時(shí)，生根效果總體差異不顯著，芽長(zhǎng)勢(shì)也無(wú)明顯區(qū)別，長(zhǎng)勢(shì)較好，苗比較健壯，隨著IBA、NAA濃度的升高，生根率呈先上升后下降趨勢(shì)，同時(shí)形成大量愈傷組織，導(dǎo)致苗長(zhǎng)勢(shì)較差，可能由于前期增殖培養(yǎng)中，所形成的叢生芽植株所蓄積的激素濃度也較多，導(dǎo)致后期生根過(guò)程中，激素濃度越高越會(huì)抑制苗的長(zhǎng)勢(shì)。

2.3.1生根率回歸方程分析 以培養(yǎng)基中IBA(B)、 NAA(C)為自變量因素，生根率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(表8)得到回歸方程為Y=78.65+5.99A+2.81B+4.95×A×B-18.62A2-4.55B2,其中,相關(guān)系數(shù)R2=0.940 9,校正決定系數(shù)R2=0.898 6。該回歸方程的P值=0.000 4<0.01,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗(yàn)分析得F=0.157 5,P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。從表8可知,A、A2差異極顯著(P<0.01),AB差異顯著(P<0.05)。表明激素6-BA濃度對(duì)銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)出不定芽有著極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對(duì)誘導(dǎo)出不定芽有顯著性影響。通過(guò)Design-Expert V 8.0.6軟件得到最優(yōu)誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基的6-BA、IBA和GA3濃度分別為A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1。

表8 生根培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表9 響應(yīng)面回歸系數(shù)方差分析

2.3.2響應(yīng)面和等高線(xiàn) 通過(guò)擬合方程繪制因素間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖,考察響應(yīng)面的形狀。由圖9可知,IBA和IBA以及IBA和NAA的交互作用顯著,NAA和NAA交互作用不顯著。其中，6-BA濃度對(duì)植株不定芽誘導(dǎo)的影響最大。因此,推測(cè)銀葉金合歡生根對(duì)培養(yǎng)基中的敏感性為IBA>NAA。

圖3 IBA和NAA濃度對(duì)銀葉金合歡生根影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)

2.3.3最佳激素濃度配比及驗(yàn)證 通過(guò)二次回歸方程的分析可得出銀葉金合歡生根培養(yǎng)基的最優(yōu)條件為A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1,經(jīng)計(jì)算，該配比培養(yǎng)條件下銀葉金合歡莖段的理論生根率為79.906 7%。而通過(guò)實(shí)際試驗(yàn)測(cè)試獲得的平均生根率為85.67%,與預(yù)測(cè)值基本一致,比原13個(gè)組合中最高生根率高出3.99%，說(shuō)明方程與真實(shí)試驗(yàn)擬合度較好，證實(shí)了該模型的有效性。

2.4 組培苗移栽

將生根培養(yǎng)30 d后的組培苗，移至溫室中不開(kāi)蓋煉苗7 d，這樣可以保持瓶?jī)?nèi)外環(huán)境的一致，使得組培苗能夠更好地適應(yīng)室外的自然環(huán)境。移栽前1 d，將培養(yǎng)瓶旋開(kāi)，之后將苗取出，洗凈根上黏附的培養(yǎng)基，同時(shí)用多菌靈或者高錳酸鉀溶液浸泡消毒2 min，隨后移栽至經(jīng)消毒處理的基質(zhì)中，基質(zhì)配置比例為黃心土∶沙(2∶1)，覆蓋薄膜保溫保濕，并用遮陰網(wǎng)遮陰。20 d后，揭開(kāi)薄膜進(jìn)行常規(guī)水肥管理，1個(gè)月后調(diào)查其存活率可達(dá)到90%以上。

3 討論與結(jié)論

響應(yīng)面分析法是一種可以減少試驗(yàn)次數(shù)，使用方便，回歸預(yù)測(cè)性好的優(yōu)化分析方法[11]。相對(duì)于以往的分析方法，響應(yīng)面分析法獲得各個(gè)試驗(yàn)參數(shù)組合更加精確，可以減少試驗(yàn)次數(shù)，進(jìn)而減少試驗(yàn)浪費(fèi)。在植物組培試驗(yàn)中,最常用的試驗(yàn)方法是正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),但是正交試驗(yàn)方法只是對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)進(jìn)行分析，無(wú)法找到各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。牟會(huì)榮等[12]、蔡厚道[13]利用以上兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與研究,均發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法優(yōu)于正交法。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)銀葉金合歡的研究主要集中對(duì)種子萌發(fā)特征[5]、育苗技術(shù)[14]等方面，國(guó)外對(duì)銀葉金合歡的研究主要在于分類(lèi)特征、種類(lèi)鑒定、分布以及引種栽培，關(guān)于優(yōu)化銀葉金合歡組培培養(yǎng)基的響應(yīng)面法還沒(méi)見(jiàn)報(bào)道，由于銀葉金合歡屬于豆科金合歡屬常綠小喬木，又屬于相思類(lèi)植物，因此，本研究主要參考金合歡屬或者相思類(lèi)植物的組培方法。曾少玲等[15]在馬大雜種相思無(wú)性系的組培快繁試驗(yàn)中馬大雜種相思理想的外植體材料是當(dāng)年生枝條第3～5個(gè)腋芽莖段；王鴻等[16]在16年生大葉相思高效芽誘導(dǎo)、增殖體系研究中發(fā)現(xiàn)最優(yōu)外植體是8月取當(dāng)年生枝條第3～5腋芽莖段。因此，本研究在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中選擇的銀葉金合歡外植體為帶腋芽的莖段。同時(shí)在誘導(dǎo)培養(yǎng)中，采用CCD設(shè)計(jì)篩選出最優(yōu)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3，實(shí)際誘導(dǎo)率為62.35%，高于李蕊萍等[6]報(bào)道的誘導(dǎo)率54.33%，當(dāng)然根據(jù)響應(yīng)面法因素間交互作用的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖分析發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響最大，其次是IBA濃度，對(duì)植株再生頻率影響最小的是GA3濃度，這與李蕊萍等[6]對(duì)銀葉金合歡誘導(dǎo)試驗(yàn)中所使用的基本培養(yǎng)基以及激素種類(lèi)一致。在銀葉金合歡的增殖培養(yǎng)中，篩選出最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3，該組合的銀葉金合歡莖段實(shí)際平均增殖系數(shù)為3.68，高于李蕊萍等[6]報(bào)道的銀葉金合歡組培增殖系數(shù)(3.44)、王鴻等[16]報(bào)道的大葉相思組培增殖系數(shù)(2.63)以及黃烈健等[17]報(bào)道的黑木相思組培增殖系數(shù)(3.12)。在增殖培養(yǎng)過(guò)程中，激素6-BA、IBA、GA3濃度對(duì)銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)不定芽存在極顯著差異，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對(duì)誘導(dǎo)不定芽影響差異顯著，但是IBA濃度與GA3濃度的交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著。激素6-BA濃度對(duì)銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)不定芽有極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對(duì)誘導(dǎo)不定芽有顯著影響。本研究篩選出的銀葉金合歡最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.64 mg·L-1IBA+0.14 mg·L-16-BA，在此培養(yǎng)基配方下銀葉金合歡莖段的實(shí)際平均生根率為85.67%，高于李蕊萍等[6]報(bào)道的銀葉金合歡組培生根率(67.10%)，低于黃玉梅等報(bào)道的黑木相思組培生根率(94.45%)[18]、寧昭然等[19]報(bào)道的黑木相思組培生根率(96.63%)以及王鴻等[20]報(bào)道的卷莢相思組培生根率(96.11%)，原因可能是添加不同激素種類(lèi)以及濃度配比的不同而導(dǎo)致?？傮w來(lái)說(shuō)銀葉金合歡生根率低于其他相思類(lèi)植物；同時(shí)IAA和IBA兩種生長(zhǎng)素交互作用比單獨(dú)作用能使相思類(lèi)植物生根率提高，但其具體機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究以銀葉金合歡誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)、生根率作為響應(yīng)值，結(jié)合CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析各處理之間的總體差異，對(duì)得到的試驗(yàn)結(jié)果再進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果可靠。因此，響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)不同品種、不同培養(yǎng)條件、不同的培養(yǎng)過(guò)程方面應(yīng)用前景將非常廣泛，極大促進(jìn)植物組織培養(yǎng)研究技術(shù)的進(jìn)步。