胡國華

隨著社會的發(fā)展和人們對食品要求的提高，食品安全問題被提到越來越重要的位置，食品安全檢測的方法也在不斷地更新迭代。食品被細菌污染的程度可用來判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，針對食品中的微小顆粒以及顏色特殊的產(chǎn)品做菌落總數(shù)計數(shù)時，無論是我國的國家標準還是ISO標準都存在相同的問題，比如食品中的微小顆粒與菌落相似、樣品本身的顏色原因?qū)е戮潆y以觀察，從而影響試驗過程中菌落總數(shù)的觀察和計數(shù)，使檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差。

參照《化妝品安全技術規(guī)范》（2015年版）第五章微生物檢驗方法中菌落總數(shù)檢驗方法的描述內(nèi)容，為了便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在培養(yǎng)基中加入TTC（紅四氮唑，又叫2，3，5-三苯基氯化四氮唑）溶液，利用TTC在菌落生長過程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶使無色的TTC還原成紅色的TPF原理，使菌落更容易觀察和計數(shù)。但對于TTC的濃度，各類文獻給出的結(jié)果不完全一致，本文選擇自然界中比較常見的革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌-大腸埃希氏菌以及芽孢菌-枯草芽孢桿菌作為試驗菌種，以麥片和乳粉為樣品基質(zhì)，對TTC的濃度進行確認，確定最佳使用濃度，對食品中菌落總數(shù)的檢測方法進行優(yōu)化，從而提高檢測結(jié)果的準確性。

一、材料

平板計數(shù)瓊脂，北京陸橋；營養(yǎng)肉湯，北京路橋；培養(yǎng)皿，瑾博；TTC，麥克林；大腸埃希氏菌，ATCC 8739；金黃色葡萄球菌，ATCC 6538；枯草芽孢桿菌，ATCC 9372；生物安全柜，1384；恒溫培養(yǎng)箱，DHP-9162；電子天平，MP3KC；移液器，GP00180。

二、方法

1.菌種的制備。各取1環(huán)工作菌種接種至9mL的營養(yǎng)肉湯中，在36℃條件下培養(yǎng)18-24小時，此時的菌種濃度約為1.0×109CFU/mL。使用無菌生理鹽水對菌液進行稀釋，根據(jù)常用的食品安全標準，食品中的大部分限量值為103-105CFU/g，因此將菌液濃度稀釋至105CFU/mL、106CFU/mL備用。

2.不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂制備。配制平板計數(shù)瓊脂，經(jīng)121℃滅菌15分鐘后置于60℃的水浴中，將TTC用無菌水配制成5%的濃度，過濾除菌后備用。以無菌操作添加到平板計數(shù)瓊脂中，使得平板計數(shù)瓊脂中TTC的濃度分別為0.08%、0.06%、0.04%、0.02%、0.01%、0.008%、0.004%、0.002%、0.001%、0.0008%、0.0004%、0.0002%、0.0001%，制備好后放在48℃的水浴中備用。

3.操作步驟。取制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌1mL至培養(yǎng)皿中，每個濃度TTC的培養(yǎng)基準備2個培養(yǎng)皿，加入含不同濃度TTC的PCA培養(yǎng)基和2個不含TTC的培養(yǎng)基作為對照組。培養(yǎng)基凝固后反轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，在36℃條件下培養(yǎng)48小時。金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌在含不同濃度TTC培養(yǎng)基中的菌落計數(shù)及菌落顏色如表1所示。

由表1可知，當TTC濃度≥0.0010%時，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識度較明顯；當TTC濃度≤0.0020%時，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)相比無明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對金黃色葡萄球菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0020%。當TTC濃度≥0.0010%時，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識度較明顯；當TTC濃度≤0.0080%時，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的大腸埃希氏菌的菌落數(shù)無明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對大腸埃希氏菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0080%。當TTC濃度≥0.0010%時，菌落呈現(xiàn)粉紅色，顏色的辨識度較明顯；當TTC濃度≤0.0080%時，菌落總數(shù)的數(shù)值與不添加TTC培養(yǎng)基的枯草芽孢桿菌的菌落數(shù)無明顯減少（差異小于0.25log10N），因此對枯草芽孢桿菌的最佳使用濃度范圍為0.0010%-0.0080%。結(jié)合三種菌種的試驗結(jié)果，食品中TTC的濃度在0.0010%- 0.0020%之間較為適宜。

4.在具體產(chǎn)品中的驗證方法。設計麥片和牛奶兩類產(chǎn)品樣品，為了結(jié)果便于統(tǒng)計，將牛奶和麥片進行高壓滅菌冷卻后，稱取25g的麥片和25mL的牛奶于均質(zhì)袋中，每個樣品稱取3個平行。將制備好的菌液分別各取1份混合，使得混合后的菌液濃度約為105CFU/mL，每個樣品的加菌量為1mL，使得樣品的最終濃度為103CFU/g，加入225mL的稀釋液后得到10-1稀釋液，按照梯度稀釋到10-2、10-3稀釋液。每個稀釋度取各取1mL至4個無菌培養(yǎng)皿中，2個培養(yǎng)皿中加入15-20mL含0.0015%TTC的PCA培養(yǎng)基，另外2個培養(yǎng)皿中加入不含TTC的PCA培養(yǎng)基。用25mL的無菌稀釋液代替樣品作為對照組，加入不含TTC的PCA培養(yǎng)基。待上述培養(yǎng)基冷卻凝固后，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿并在36℃條件下培養(yǎng)48小時，然后取出計數(shù)，計算平均結(jié)果如表2。

從表2可以看出，當采用含0.0015%TTC的PCA時，樣品中的菌落總數(shù)與對照組的菌落總數(shù)接近；未采用TTC的PCA組，因為牛奶本身的顏色、麥片的細小顆粒物導致培養(yǎng)基上一些顏色和樣品本底顏色接近的菌落以及與細小顆粒物接近或者生長時疊加在樣品顆粒物上時，會導致菌落無法被觀察到，從而使得檢測結(jié)果與真實值有一定的差異。雖然未加TTC組的數(shù)據(jù)也符合ISO 4833中重復性的要求（小于0.25log10N），但0.0015%TTC的PCA組更有利于菌落的觀察和計數(shù)，減少了因樣品本身的性狀、顏色對檢測結(jié)果的影響，使檢測結(jié)果更加準確可靠。

三、總結(jié)與討論

食品在實際加工過程中以及原料被污染的細菌種類較多，本次試驗選取了比較有代表性的3種菌種進行方法確認，主要驗證在商業(yè)干粉培養(yǎng)基配制過程中添加一定濃度的TTC便于對實驗結(jié)果的觀察和計數(shù)，同時驗證了最佳的使用濃度，既方便觀察，又對檢測結(jié)果沒有影響，能夠提高本身顏色較特殊以及含有細小顆粒的樣品菌落總數(shù)檢測項目的準確性。