李立峰，胡公義，侯若南，吳 和，齊艷紅

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1.急診醫(yī)學(xué)科；2.全科醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000)

肝性腦病(hepatic encephalopathy, HE)是一種由于急、慢性肝功能嚴(yán)重障礙或各種門靜脈-體循環(huán)分流異常所致的，以代謝紊亂為基礎(chǔ)的，輕重程度不同的神經(jīng)精神異常綜合征。HE是肝硬化患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是肝硬化患者死亡的常見原因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國外肝硬化患者HE發(fā)生率高達(dá)30%～45%[2]，國內(nèi)肝硬化患者HE發(fā)生率為10%～50%，概率隨肝功能損害程度加重而升高。肝硬化患者并發(fā)HE后，若救治不及時(shí)死亡率極高，有文獻(xiàn)[3]報(bào)道其1年存活率低于50%，3年存活率低于25%。早期快速診斷、科學(xué)客觀評估病情有助于準(zhǔn)確判斷肝硬化并發(fā)肝性腦病患者的預(yù)后，提高肝性腦病患者的救治成功率。當(dāng)前尚缺乏對肝性腦病診斷和評估的有效實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，本研究通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)，采用主成分分析法和最小二乘法判別分析對肝性腦病患者血清代謝成分進(jìn)行分析，結(jié)合生化指標(biāo)檢測等手段，尋找診斷和評估病情的特征性代謝產(chǎn)物，為臨床肝性腦病的診斷和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1 月—2019年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診留觀的肝硬化合并肝性腦病患者18例，男12例，女6例，平均年齡(55.3±10.5)歲。同時(shí)選取肝硬化未合并肝性腦病的53例患者作為肝硬化對照組，男35例，女18例，平均年齡(54.1±11.1)歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象由本人或代理人簽署知情同意書。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 肝硬化的納入標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社第八版《內(nèi)科學(xué)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)有乙肝肝硬化或酒精性肝硬化病史；(2)有肝功能減退和門靜脈高壓的臨床表現(xiàn)；(3)有血漿白蛋白下降、總膽紅素升高、凝血酶原時(shí)間延長等異常指標(biāo)，提示肝功能失代償期；(4)超聲或影像學(xué)結(jié)果提示肝硬化，內(nèi)鏡結(jié)果提示胃底食管靜脈曲張。肝組織活檢見假小葉的形成是診斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)。肝性腦病的納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)有嚴(yán)重肝病或廣泛門-體分流的基礎(chǔ)；(2)意識障礙、智力異常、精神紊亂，可引出撲翼樣震顫(+)；(3)有明確 HE 誘因；(4)反映肝功能損害的生化指標(biāo)明顯異?；蜓泵黠@增高；(5)腦電圖典型改變有重要參考價(jià)值。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?2)器官移植術(shù)后；(3)惡性腫瘤；(4)妊娠；(5)HIV感染。

1.3 UPLC-MS/MS分析 入院6 h內(nèi)，經(jīng)靜脈穿刺術(shù)采集患者全血，離心取血清(3 000 r/min離心10 min，離心半徑13.5cm)。100 μL血清樣品加300 μL乙腈，渦旋混合1 min，4℃ 13 000 r/min(離心半徑13.5cm) 離心10 min。取150 μL上清液于進(jìn)樣瓶的內(nèi)襯管中，取2 μL注入U(xiǎn)PLC-MS/MS分析。采用ACQUITY UPLC和XEVO TQS-micro三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters公司，美國)，UPLC HSS C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱分離，柱溫為40℃。采集的血漿供HPLC-MS檢測，優(yōu)化色譜條件使色譜峰充分分離，標(biāo)記信噪比>10的色譜峰并進(jìn)行峰面積積分。

1.4 常規(guī)生化分析 采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測患者血清白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)、INR、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Sr)，白蛋白(Alb)和血氨等生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)生化指標(biāo)水平比較 與肝硬化對照組比較，肝性腦病組患者血氨水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組間WBC、Hb、PLT、INR、ALT、Sr、Alb水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者常規(guī)生化指標(biāo)水平比較

2.2 血清代謝產(chǎn)物水平比較 與肝硬化對照組比較，肝性腦病組患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇、乙酰肉堿和犬尿氨酸水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者血清代謝產(chǎn)物水平比較

3 討論

目前，肝性腦病早期診斷和病情評估主要依據(jù)患者臨床表現(xiàn)，神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)心理學(xué)測試，影像學(xué)檢查及肝功能、血氨等實(shí)驗(yàn)室檢查。當(dāng)前尚缺乏對肝性腦病準(zhǔn)確診斷和評估的方法和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)生化指標(biāo)中僅血氨水平肝性腦病患者比肝硬化組明顯升高，其他常規(guī)生化檢測指標(biāo)無明顯差異。UPLC-MS/MS檢測能夠高效、靈敏、準(zhǔn)確地探索分析未知化合物，目前廣泛應(yīng)用于生物代謝組學(xué)研究[6-8]。本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)檢測兩組患者血清成分，共檢測出20種代謝物，與肝硬化組比較，肝性腦病組患者血清中乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇、乙酰肉堿和犬尿氨酸水平明顯升高。

本研究結(jié)果顯示，乙酰化代謝產(chǎn)物明顯增加(乙酰半胱氨酸、乙酰氨基、4-乙酰氨基丁酸、L-苯乙酰谷氨酰胺)，可能是由于高血氨影響三羧酸循環(huán)代謝，導(dǎo)致丙酮酸氧化β-氧化途徑代償性增加，產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，進(jìn)而導(dǎo)致乙?；x產(chǎn)物的增加，提示肝性腦病患者體內(nèi)發(fā)生能量代謝改變。目前，有關(guān)肝性腦病能量代謝的變化主要通過動(dòng)物或細(xì)胞水平進(jìn)行研究[9]。Weiss等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肝性腦病患者腦脊液中三羧酸循環(huán)中間體的水平?jīng)]有變化，但丙酮酸、酰肉堿和乙?；衔锏乃皆黾?。肉堿和酰肉堿水平的急劇增加可能反映了三羧酸循環(huán)活性的降低，可能與脂肪酸β-氧化途徑的代償性增加有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)肉堿類代謝產(chǎn)物增加，肉堿類代謝產(chǎn)物是脂肪酸代謝途徑的產(chǎn)物，進(jìn)一步說明肝性腦病患者體內(nèi)脂肪酸氧化途徑激活可能與體內(nèi)三羧酸能量代謝途徑被抑制而導(dǎo)致其他能量代謝途徑代償性增加有關(guān)。本研究結(jié)果顯示肝性腦病組患者乙酰肉堿水平明顯增加，而其他肉堿類代謝物水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前，肝硬化患者中肉堿和酰基肉堿水平的研究存在一定的爭議。Tang等[11]觀察到隨著原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)展，肉堿(如丙酰肉堿和丁酰肉堿)水平逐漸下降。然而，亦有文獻(xiàn)[12]報(bào)道肝硬化患者血漿中的酰基肉堿水平升高，而肉堿水平未改變。而有文獻(xiàn)[13]報(bào)道肉堿和乙酰肉堿可預(yù)防高氨血癥，并可改善高血氨對患者的毒性作用，尤其是對肝硬化患者[14]和肝性腦病患者[15]。

本研究結(jié)果還顯示，苯丙氨酸、奎寧酸、阿拉伯醇和犬尿氨酸在肝性腦病組患者中明顯增加，提示苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝以及醇類代謝等途徑在肝性腦病患者中均顯著增強(qiáng)。Dabos等[16]采用核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR)的代謝組學(xué)研究將肝硬化患者與肝性腦病患者進(jìn)行區(qū)分，基于酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙酮酸和甘氨酸代謝物特征區(qū)分肝性腦病患者和肝硬化患者，與本研究的部分代謝產(chǎn)物相類似，提示血清酪氨酸、苯丙氨酸等代謝物對識別肝硬化患者是否合并肝性腦病具有重要意義。肝性腦病患者往往存在芳香族氨基酸/支鏈氨基酸比例失調(diào)，支鏈氨基酸水平降低導(dǎo)致過多的酪氨酸、苯丙氨酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)入大腦，產(chǎn)生假神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)傳導(dǎo)異常，最終出現(xiàn)意識障礙或昏迷，這也是肝性腦病患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙的重要原因。

綜上所述，合并與未合并肝性腦病肝硬化患者具有相似的代謝障礙，提示肝性腦病和肝硬化具有相類似的病理生理機(jī)制，肝性腦病是肝硬化更為嚴(yán)重的階段。本研究通過UPLC-MS/MS檢測肝性腦病和肝硬化患者血液代謝產(chǎn)物變化，研究結(jié)果對肝性腦病的臨床診斷及治療具有一定的意義。