胡虎蘭，姚金金

(1.杭州市第九人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 311225；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310015)

中國(guó)是肝病大國(guó)，現(xiàn)有的肝病種類(lèi)包括病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等[1]。隨著疾病進(jìn)展，任何種類(lèi)的肝病均可出現(xiàn)進(jìn)一步惡化，肝臟疾病的有效診治顯得尤為重要。去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝細(xì)胞膜表面的一種異源低聚物內(nèi)吞受體，又稱(chēng)為半乳糖/N-乙?；咸前肥荏w、Ashwell-Morell受體、肝凝集素。ASGPR特定于肝細(xì)胞膜表面，特異性識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)載糖蛋白[2]。本文綜述目前ASGPR在各類(lèi)肝臟疾病診治中的應(yīng)用。

1 肝臟疾病流行病學(xué)現(xiàn)狀

據(jù)WHO報(bào)道，每年有一定數(shù)量的肝病患者死亡，2015年約有134萬(wàn)人死于病毒性肝炎。病毒性肝炎按病原學(xué)可分為甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。全球每年約140萬(wàn)人感染甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)，HAV主要通過(guò)糞—口傳播，因此其發(fā)病率隨經(jīng)濟(jì)水平及衛(wèi)生狀況波動(dòng)。盡管甲型病毒性肝炎屬于自限性疾病，但易引起大規(guī)模暴發(fā)和流行，且當(dāng)前甲肝疫苗及治療藥物尚不成熟[3]，嚴(yán)重者仍可引起死亡。2015年，全球約有1.1萬(wàn)人死于HAV感染。全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者高達(dá)2.57億，我國(guó)高達(dá)7千萬(wàn)。近年來(lái)，乙肝疫苗及抗HBV藥物應(yīng)運(yùn)而生，HBV感染控制成效顯著，然而HBV仍無(wú)法達(dá)到完全根治的目的，全球每年約有88.7萬(wàn)人死于HBV感染[1]。全球約有7 100萬(wàn)人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，每年約有39.9萬(wàn)人死于HCV感染并發(fā)癥，現(xiàn)有的抗病毒藥物存在治療適應(yīng)證局限及不良反應(yīng)[4]。全球每年約有2 000萬(wàn)人感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)。戊型病毒性肝炎屬于食源性人畜共患疾病，大部分HEV感染者存在臨床表達(dá)沉默和自我限制的特點(diǎn)，但仍有引起慢加急或急性肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，急性暴發(fā)流行多見(jiàn)于衛(wèi)生條件落后的國(guó)家，每年約有5.6萬(wàn)人死于HEV[5]。

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)受遺傳和環(huán)境等因素影響，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療方法不一，易合并出現(xiàn)肝硬化。禁錮于現(xiàn)有的診斷手段，自身免疫性肝病的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)并不完全[6]。隨著生活水平的提高，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病率逐步提升，全球每年有330萬(wàn)人死于過(guò)量飲酒[7]，NAFLD患病率為6.3%～45.0%，其中中東和南美洲患病率最高，亞洲最低[8]。

肝纖維化是肝硬化的早期階段，肝硬化、肝癌是肝病的終末環(huán)節(jié)且不可逆轉(zhuǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌是全球第五大常見(jiàn)腫瘤，在腫瘤致死率中排名第2[9]。

2 ASGPR概述

2.1 ASGPR結(jié)構(gòu) ASGPR由46 kD主要亞基ASGPR(H1)和50 kD次要亞基ASGPR2(H2)組成，含量比為3：1，均為Ⅱ型單次跨膜糖蛋白。ASGPR主要分布于肝小葉的門(mén)靜脈周?chē)?，每個(gè)肝細(xì)胞約有1×105～5×105個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，富集于網(wǎng)格蛋白聚集處。ASGPR根據(jù)功能區(qū)劃分為胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、蒂區(qū)和糖識(shí)別域，其中因糖識(shí)別域識(shí)別并結(jié)合配體的機(jī)制為鈣離子依賴(lài)，故屬C型凝集素。配體被H1亞基有效識(shí)別結(jié)合后，通過(guò)H1、H2亞基共同完成內(nèi)吞作用。ASGPR亦分布于細(xì)胞內(nèi)囊泡組織、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，參與一系列的運(yùn)輸過(guò)程，配體最終在溶酶體中被降解[10]。

2.2 ASGPR檢測(cè)方法 目前，ASGPR有多種檢測(cè)方法，基礎(chǔ)步驟為以pET3-CRDH1為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增CRDH1基因，定向克隆至原核表達(dá)載體pET-32c中。含有CRDH1/pET-32c的BL21單菌落通過(guò)TPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni2+螯合柱親和純化其表達(dá)產(chǎn)物。H1/H1b最終檢測(cè)方法可采用：(1)免疫印跡技術(shù)分析其免疫反應(yīng)性，該方法對(duì)H1b亞基特異性識(shí)別，尤其是天然構(gòu)象的內(nèi)源性H1b亞基，但不識(shí)別H1a亞基，且該檢測(cè)方法要求采用肝臟組織標(biāo)本[11]。(2)間接法rH1-IgG-ELISA，該方法具有較好的敏感性及特異性，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本的純度要求不高，但操作過(guò)程復(fù)雜，成本高[12]。(3)捕獲噬菌體酶免疫吸附試驗(yàn)法，該檢測(cè)方法假陽(yáng)性率低，具有高效率的篩選能力，但對(duì)標(biāo)本純度要求苛刻[13]。(4)流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)法，該檢測(cè)方法特異性良好，可用于鑒別原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌，但對(duì)肝組織細(xì)胞完整性要求高[14]。H2檢測(cè)方法可采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)，該方法基于mRNA水平檢測(cè)，特異性高，僅需血清標(biāo)本即可完成，操作簡(jiǎn)便[15]。H2a檢測(cè)方法可采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，該方法操作簡(jiǎn)單且已制備成試劑盒，具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，對(duì)標(biāo)本要求不高，但仍需大樣本檢測(cè)優(yōu)化方法[16]。

3 ASGPR在肝臟疾病診治中的應(yīng)用

3.1 病毒性肝炎

3.1.1 甲型病毒性肝炎 HAV與ASGPR相關(guān)性的研究較少。Dotzauer 等[17]采用定量檢測(cè)HAV負(fù)鏈RNA，表明HAV通過(guò)形成HAV-抗HAV IgA復(fù)合物經(jīng)ASGPR介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，HAV逃逸，基因組RNA釋放，病毒大量復(fù)制，導(dǎo)致肝臟疾病惡化。

3.1.2 乙型病毒性肝炎 Sewing等[18]利用HBV通過(guò)ASGPR介導(dǎo)完成肝細(xì)胞感染機(jī)制制備的抗病毒藥物具有靶向性強(qiáng)和腎臟毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。HBV附著于PreS1區(qū)的21～47氨基酸位點(diǎn)，一種50 kD的糖蛋白(含有N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖殘基)通過(guò)特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合PreS1區(qū)，使HBV能被ASGPR識(shí)別并介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，HBV入胞后開(kāi)始復(fù)制工作[19]。Vyas等[20]在研究胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，母體HBV感染者ASGPR表達(dá)增加；通過(guò)免疫熒光檢測(cè)到在滋養(yǎng)層和胎盤(pán)樹(shù)突狀細(xì)胞中存在A(yíng)SGPR和HBV共同位點(diǎn)，認(rèn)為樹(shù)突狀細(xì)胞是HBV載體，能被ASGPR識(shí)別，通過(guò)ASGPR通道完成HBV的內(nèi)吞、結(jié)合和攝取過(guò)程。但ASGPR在垂直傳播中的作用并未被證實(shí)。Javanbakht等[21]將用于抗病毒治療的單鏈寡核苷酸(single-stranded oligonucleotide，SSO)置于鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)平臺(tái)，形成LNA-SSO復(fù)合物。該LNA-SSO復(fù)合物與3個(gè)N-乙酰半乳糖結(jié)合，可特異性識(shí)別肝細(xì)胞表面的ASGPR，經(jīng)該受體介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到高效的抗病毒作用。Latavia等[22]采用ASGPR特異性配體(包括半乳糖、乙酰半乳糖胺、亞細(xì)胞苷)嘗試標(biāo)記載體，與藥物結(jié)合運(yùn)送至肝細(xì)胞內(nèi)，提高藥物攝取率。隨著研究進(jìn)展，新的ASGPR特異性配體層出不窮，包括納米粒子(無(wú)機(jī)納米粒子、高分子納米粒子)、脂類(lèi)(可電離脂質(zhì)納米粒子、陽(yáng)離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、高密度脂蛋白、固體脂質(zhì)納米粒子)、細(xì)胞穿膜肽、HBV附著物抑制劑。

3.1.3 丙型病毒性肝炎 研究[23]表明，HCV p7可上調(diào)ASGPR1基因表達(dá)，ASGPR1啟動(dòng)子順式激活下游基因，促進(jìn)HCV與肝細(xì)胞結(jié)合。利用siRNA制成的靶向制劑可顯著增加HCV清除率。Lakshminarayanan等[24]采用聚丙烯醚亞胺樹(shù)突狀大分子，與siRNA相互作用結(jié)合，靶向傳遞siRNA至肝細(xì)胞內(nèi)HCV核周區(qū)域，可有效抑制HCV復(fù)制。Willoughby等[25]研究表明，GalNAc-siRNA技術(shù)可應(yīng)用于肝靶向，且可降低ASGPR表達(dá)的疾病狀態(tài)。

3.1.4 戊型病毒性肝炎 目前，HEV與ASGPR相關(guān)性研究較少。Zhang等[26]通過(guò)免疫沉淀、下拉和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HEV ORF2蛋白直接與ASGPR1和ASGPR2的外區(qū)相互作用，促使HEV與肝細(xì)胞結(jié)合并進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致HEV感染的發(fā)生。

3.2 自身免疫性肝病 ASGPR抗體對(duì)AILD的診斷特異性高，免疫系統(tǒng)中的部分免疫球蛋白經(jīng)ASGPR介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；AILD患者血清中ASGPR抗體含量高，可作為檢測(cè)、評(píng)估病情輕重及預(yù)后情況的重要標(biāo)志[27]。

3.3 酒精性肝病 乙醇可引起肝細(xì)胞ASGPR表達(dá)下降，損害ASGPR功能，ALD的損傷程度與ASGPR存在相關(guān)性。ASGPR可識(shí)別末端含有半乳糖或N-乙酰半乳糖殘基的糖蛋白，可去除潛在有害的去解離糖蛋白，同時(shí)參與凋亡細(xì)胞的攝取[28]。ALD患者中的ASGPR表達(dá)下降，但仍保存部分ASGPR通道的完整性。Wang等[29]將當(dāng)歸多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)通過(guò)酯化反應(yīng)合成雙性膽固醇半琥珀酸-ASP(ASP-CHEMS)，再裝配成ASP-CHEMS納米粒子，合成ACNPs。ACNPs可有效結(jié)合ASGPR，并利用ASGPR通道進(jìn)入肝細(xì)胞。相較于A(yíng)SP通過(guò)非ASGPR通道進(jìn)入肝細(xì)胞，前者使ASP具有更高的溶解性、光穩(wěn)定性及肝臟靶向性，達(dá)到更好的治療效果?；贏(yíng)CNPs可利用ALD患者僅存的ASGPR通道達(dá)到更好的治療效果。

3.4 非酒精性脂肪肝 ASGPR1屬于肝細(xì)胞源性循環(huán)細(xì)胞外囊泡(circulating extracellular vesicles，EVs)，而EVs是非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的新興生物標(biāo)志物，Li等[30]發(fā)現(xiàn)在NASH小鼠中，ASGPR1隨著飼養(yǎng)周期延長(zhǎng)而逐步升高，ASGPR1可作為NASH診斷和隨訪(fǎng)的新生標(biāo)志物。

3.5 肝纖維化 在肝纖維化患者中，ASGPR水平降低。Wang等[31]采用ASGPR染色法在小鼠中得到了證實(shí)。

3.6 肝硬化 景博瓊等[32]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的抗ASGPR水平明顯高于健康者及慢性肝炎患者，認(rèn)為抗ASGPR有助于臨床診治的鑒別診斷，有幫助治療和評(píng)估預(yù)后的價(jià)值。

3.7 肝癌 Ding等[33]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中ASGPR1基因表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為ASGPR1水平與肝癌晚期淋巴轉(zhuǎn)移TNM分期有關(guān)，推測(cè)ASGPR1可抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，并抑制肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲。肝癌靶向治療藥物與乳糖化衍生物結(jié)合，通過(guò)ASGPR介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，既增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效又減少對(duì)其他組織的毒副反應(yīng)。研究[34-37]發(fā)現(xiàn)，可用于結(jié)合ASGPR的載體包括糖基化前藥、糖基化小分子納米藥物載體、糖基化基因復(fù)合物，其中糖基化小分子納米藥物載體包括聚合物膠束、脂質(zhì)體、糖基化殼聚糖載體、樹(shù)枝狀聚合體、金納米粒子、果膠等。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，ASGPR肝臟特異性強(qiáng)，參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。目前基于A(yíng)SGPR制備了部分新型制劑，當(dāng)前制劑仍以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用為主，還未真正應(yīng)用于臨床醫(yī)療，亟待進(jìn)一步深入研究，以發(fā)揮其更大的臨床價(jià)值。