呂 堯，戴偉民，揭園慶，余國峰

(衢州市人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 衢州 324000)

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，主要治療方式包括外科手術(shù)和放化療[1-2]。微小RNA(micro RNA， miRNA)可調(diào)控蛋白編碼，影響蛋白表達(dá)，在許多信號通路中起到關(guān)鍵作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在腦膠質(zhì)瘤患者和腦組織正常人群中的表達(dá)具有差異性。李會兵等[4]認(rèn)為miR-138異常表達(dá)可影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡，梁燕等[5]認(rèn)為Notch-1信號通路活化可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與分化。本研究觀察腦膠質(zhì)瘤患者miR-138和Notch-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，觀察miR-138表達(dá)水平對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG Notch-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討miR-138在腦膠質(zhì)瘤中的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG購自上海素爾生物科技有限公司，miR-138轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪公司，Trizol試劑、PVDF膜、U6內(nèi)參檢測試劑盒購自Invitrogen公司，2 000 bp DNA marker購自鄭州實(shí)驗(yàn)器材有限公司，牛血清蛋白(BSA)購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)、CCK 8試劑盒購自Gibco公司，miRNA熒光定量PCR試劑盒購自Stratagene Crop公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，高速離心機(jī)購自德國Eppendrof公司，熒光定量PCR儀(7500Fast)購自美國ABI公司。

1.2 研究對象一般資料 2018年1月—2019年1月于衢州市人民醫(yī)院收集18例鑒定為腦膠質(zhì)瘤患者的腦組織活檢標(biāo)本和5例神經(jīng)外科腦外傷手術(shù)患者的正常腦組織活檢標(biāo)本，采集標(biāo)本前均獲得患者或家屬知情同意，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。腦膠質(zhì)瘤患者平均年齡(52.33±13.42)歲，男12例、女6例， WHO分級：I級5例、Ⅱ級6例、Ⅲ級7例，病理學(xué)類型：星形細(xì)胞瘤11例、間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例、間變星形細(xì)胞瘤3例。腦膠質(zhì)瘤患者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合腦腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，病理檢查確診為腦膠質(zhì)瘤，臨床資料完整；排除合并其他腫瘤疾病及精神疾病、抑郁癥等與腦部相關(guān)的疾病患者。5例腦外傷手術(shù)患者平均年齡(52.41±12.78)歲，男3例、女2例。腦組織取出后用生理鹽水沖洗干凈，置于液氮中迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織miR-138表達(dá)水平檢測 取出組織標(biāo)本，在液氮預(yù)冷研缽里研磨，利用Trizol法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為16℃ 5 min、42℃ 45 min、85℃ 5 min和10℃停止。利用熒光定量PCR檢測腦組織miR-138表達(dá)水平，每例標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔，94 ℃作用3 min，94℃ 作用20 s，反應(yīng)40個循環(huán)；62℃作用40 s，反應(yīng)40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG用含10%胎牛血清和90%RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞以1.5×105個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為Mimics組、Inhibitor組、Blank組，Mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體復(fù)合物和miR-138 mimics，Inhibitor組細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體復(fù)合物和miR-138 inhibitor，Blank組只加脂質(zhì)體。按照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cRNA后，采用熒光定量PCR檢測miR-138表達(dá)水平。

1.5 Western Blot法 檢測Notch-1信號通路相關(guān)蛋白Notch-1和Hes-1的表達(dá)，組織和細(xì)胞提取的蛋白按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，與TBST按1∶200稀釋一抗，室溫封閉2 h。洗膜后加入與TBST按1∶4 000稀釋二抗，室溫孵育1 h；化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，掃描膠片，結(jié)果用Image Pro Plus 6.0 分析目標(biāo)條帶的積分光密度(IOD)值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白IOD值/內(nèi)參IOD值。

1.6 半定量PCR法 檢測Notch1 mRNA和Hes1 mRNA水平，用Trizol法提取組織和細(xì)胞總RNA，按RT-PCR 試劑盒說明書步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以PCR產(chǎn)物量作為衡量相應(yīng)基因表達(dá)水平的半定量指標(biāo)，用電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統(tǒng)(quantity-one分析軟件)行半定量分析，計(jì)算所得產(chǎn)物的積分光密度與各自內(nèi)參照積分光密度的比值表示mRNA相對表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 96孔培養(yǎng)板中分別接種2×103個/孔的Mimics組、Inhibitor組和Blank組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基和10 μL CCK溶液置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞測定450 nm波長吸光度值，24 h/次，連續(xù)3次，繪制生長曲線。

1.8 細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染16 h后，換含10% FBS培養(yǎng)基對各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以WST-8法[7]測定培養(yǎng)0、3、5、7 d的活細(xì)胞數(shù)，根據(jù)活細(xì)胞的增殖數(shù)目判斷各組細(xì)胞的分化能力。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，3組及3組以上組間計(jì)量資料比較單因素方差分析；方差齊時(shí)兩兩比較進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織miR-138表達(dá)水平 miR-138表達(dá)水平在不同WHO分級和病理類型的腦膠質(zhì)瘤組織中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織miR-138表達(dá)水平比較

表1(續(xù))

2.2 組織Notch-1和Hes-1表達(dá)水平 與正常腦組織比較，病理類型為星形細(xì)胞瘤、間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變星形細(xì)胞瘤的Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA相對表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的Notch-1和Hes-1表達(dá)水平比較

2.3 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG miR-138、Notch-1和Hes-1表達(dá)水平 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG Blank組、Mimics組、Inhibitor組的miR-138 相對表達(dá)量分別為0.63±0.02、0.92±0.05、0.46±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.966，P<0.001)。3組間Notch-1蛋白、Hes-1蛋白、Notch-1 mRNA和Hes-1 mRNA的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中Mimics組相對表達(dá)量最低，Inhibitor組相對表達(dá)量最高。見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG Notch-1和Hes-1表達(dá)水平

2.4 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG體外增殖情況 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24、48、72 h時(shí)與Blank組比較，Mimics組450 nm波長吸光度值均下降，Inhibitor組450 nm波長下吸光度值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：*與Blank組比較，P<0.05。

2.5 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG體外分化情況 WST-8檢測結(jié)果顯示，在3、5、7 d與Blank組的活細(xì)胞數(shù)比較，Mimics組的活細(xì)胞數(shù)均降低，Inhibitor組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：*與Blank組比較，P<0.05。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是以細(xì)胞異質(zhì)性、快速增殖、血管生成、廣泛性侵襲、缺氧和壞死為主要特點(diǎn)[8]。研究[9]顯示，miRNA在腦膠質(zhì)瘤的診斷、化療藥物療效的評估、抗血管生成、治療及預(yù)后判斷等方面具有重要的臨床意義。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可以特異性結(jié)合靶基因mRNA的非編碼區(qū)，調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因而影響生物學(xué)功能[10]。已發(fā)現(xiàn)上千種miRNA參與調(diào)控人體內(nèi)基因的表達(dá)，miRNA參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程，不同疾病、不同組織部位或同種疾病不同病變程度miRNA表達(dá)水平不同，因此miRNA可作為某些疾病或病變程度的預(yù)測物，如miRNA可預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后情況[11]，血清miRNA-21可預(yù)測腎癌臨床病理特征的關(guān)系以及術(shù)后復(fù)發(fā)情況[12-13]。miR-138包括位于人類3號染色體(Ch3p21.32)的miR-138-1和16號染色體(Ch16q13)的miR-138-2，廣泛表達(dá)于機(jī)體組織中[14]。miR-138在多種腫瘤疾病中呈低表達(dá)[15-16]。Notch信號是一組跨膜受體，由Notch受體、配體、Notch調(diào)節(jié)分子和其他的效應(yīng)物組成，細(xì)胞之間相互作用可產(chǎn)生Notch信號激活Notch通路。Notch-1是Notch其中一種跨膜受體，影響細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖分化，促進(jìn)腫瘤或抑制腫瘤生成[17-18]。研究[19]證實(shí)，Notch-1信號通路在膠質(zhì)瘤中充當(dāng)重要角色，Notch-1信號通路影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤患者的miR-138表達(dá)水平在WHO分級與病理類型分型中存在差異，且WHO分級Ⅱ級、Ⅲ級以及病理類型為星形細(xì)胞瘤、間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變星形細(xì)胞瘤的miR-138表達(dá)水平明顯降低。進(jìn)一步檢測組織中Notch-1信號通路相關(guān)蛋白水平發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，病理類型為星形細(xì)胞瘤、間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變星形細(xì)胞瘤的腦膠質(zhì)瘤組織的Notch-1和Hes-1表達(dá)水平明顯增高，提示Notch-1信號通路活化與腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生相關(guān)。人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87 MG轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后，miR-138相對表達(dá)量升高，Notch-1信號通路相關(guān)蛋白Notch-1和Hes-1表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖和分化作用下降；轉(zhuǎn)染inhibitor后，miR-138相對表達(dá)量降低，Notch-1和Hes-1表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖和分化作用增強(qiáng)；推測miR-138可能通過負(fù)向調(diào)控Notch-1信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化。

綜上，不同WHO分級與病理類型分型的腦膠質(zhì)瘤患者的miR-138水平在存在差異，miR-138可能通過負(fù)向調(diào)控Notch-1信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG增殖和分化，后續(xù)仍需進(jìn)行大樣本研究或動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。