鄧伶俐，劉松奇，易 順，安建輝，，譚林立

（1 湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 湖北恩施 445000 2 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北恩施 445000 3 超輕彈性體材料綠色制造民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北恩施 445000）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一種，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，降低血清膽固醇水平以及降低心血管疾病發(fā)病率等功效[1]。研究表明，從酸面團(tuán)中提取得到的植物乳桿菌T17 能夠增加腸道菌群的β-多樣性，減緩體重增加，優(yōu)化血脂和細(xì)胞因子參數(shù)[2]。為使植物乳桿菌在加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中保持較高的生物活性，通常采用包埋的方式提高其穩(wěn)定性。益生菌采用微膠囊包埋方式，通常以天然高分子或合成高分子為壁材[3]。海藻酸鈉是一種廉價(jià)、生物相容性高的益生菌包埋壁材，其形成的離子型膠體在低酸環(huán)境下穩(wěn)定，能夠增強(qiáng)菌體對(duì)胃酸的耐受性[4]。然而，也有研究認(rèn)為海藻酸鈉膠體結(jié)構(gòu)的孔徑較大，不能有效限制胃液的滲透，因此通常將海藻酸鈉與其它不同壁材混合復(fù)配使用，提高益生菌在胃腸道的穩(wěn)定性[5-6]。已有研究表明，海藻酸鈉氣凝膠可用于花青素緩釋[7]，由于氣凝膠具有較大的比表面積，能夠作為益生菌的有效載體。目前關(guān)于植物乳桿菌微膠囊包埋的方法集中于壁材和組裝過(guò)程方面，而關(guān)于以乳液為模板進(jìn)行層層自組裝方面的探索較少。1991年，Decher 提出基于靜電作用的層層自組裝概念[8]。層層自組裝法（Layer-by-layer selfassembly，LBL）是指帶有相反電荷的壁材在帶電模板上交替沉積[9]。本文研究以乳液為模板的海藻酸鈉氣凝膠通過(guò)層層自組裝吸附殼聚糖后對(duì)植物乳桿菌的包埋效果。通過(guò)紅外光譜分析各組分間的相互作用。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察氣凝膠表面及植物乳桿菌，并評(píng)價(jià)其儲(chǔ)存穩(wěn)定性和胃腸道穩(wěn)定性，為酸面團(tuán)來(lái)源的植物乳桿菌包埋提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌T17，實(shí)驗(yàn)室研究人員從酸面團(tuán)分離后保藏菌種；海藻酸鈉、殼聚糖、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽，阿拉丁試劑有限公司；氯化鈣、氯化鈉，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司。

高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；170-SX 傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet 公司；SU8010 掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械。

1.2 菌種培養(yǎng)

菌種選用實(shí)驗(yàn)室從酸面團(tuán)中分離得到的植物乳桿菌T17 （L.plantarum ZJUFT17，CCTCC No.M2017342）。挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，按2%接種量活化傳代2 次后備用。

1.3 氣凝膠制備

含植物乳桿菌的氣凝膠制備如圖1所示。取活化好的植物乳桿菌T17 菌液（約1010CFU/mL）1 mL，離心摒棄上清液，用100 μL 生理鹽水重懸，然后加入到10 mL 20 g/L 海藻酸鈉的水溶液中，用1 mL 注射器通過(guò)32 G 針頭勻速擠入到0.1 mol/L CaCl2水溶液中，靜置固化1 h 后凍干，得到含植物乳桿菌的海藻酸鈉氣凝膠（AL）。將靜置固化后的海藻酸鈉用無(wú)菌生理鹽水清洗2 遍后加入到含4 g/L 殼聚糖水溶液中進(jìn)行自組裝吸附，吸附2 h 后過(guò)濾凍干得到氣凝膠ALC（圖1a）。

取活化好的植物乳桿菌T17 菌液 （約1010CFU/mL）4 mL，離心摒棄上清液后用400 μL 生理鹽水重懸，然后加入到乳化準(zhǔn)備液中（0.4 g 乳清分離蛋白，2.0 g 玉米油，17.2 g 水），在高速均質(zhì)機(jī)作用下（12 000 r/min）剪切5 min 后將乳液與40 g/L 海藻酸鈉以體積比1∶1 混合，用1 mL 注射器通過(guò)32 G 針頭勻速擠入到0.1 mol/L CaCl2水溶液中，靜置固化1 h 后凍干，得到含植物乳桿菌的海藻酸鈉氣凝膠（EA）。將靜置固化后的海藻酸鈉用無(wú)菌生理鹽水清洗2 遍后加入到含4 g/L 的殼聚糖水溶液中進(jìn)行自組裝吸附，吸附2 h 后過(guò)濾凍干得到氣凝膠EAC（圖1b）。

圖1 層層自組裝制備海藻酸鈉/殼聚糖氣凝膠示意圖Fig.1 The schematic illustration of the preparation of lay-by-lay self-assembly sodium/chitosan aerogel

1.4 紅外光譜測(cè)定分子相互作用

根據(jù)上述步驟制備不含植物乳桿菌的氣凝膠顆粒用于紅外光譜測(cè)定，采用傅里葉變換衰減全反射法進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，累加32 次，以空氣為背景，每次掃描前扣除背景。

1.5 氣凝膠微觀形態(tài)觀察

將凍干后的AL、ALC、EA 和EAC 顆粒進(jìn)行表面噴金處理，利用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。將含有植物乳桿菌的氣凝膠加入2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜，然后按如下流程進(jìn)行樣品前處理：磷酸緩沖液洗滌3 次后采用鋨酸浸泡樣品1.5 h，使用磷酸緩沖液洗滌3 次，采用乙醇梯度脫水（30%，50%，70%，85%，90%，100%乙醇各一次），真空干燥后表面噴金處理，利用掃描電鏡觀察氣凝膠內(nèi)的植物乳桿菌。

1.6 貯藏與消化穩(wěn)定性

將按照?qǐng)D1制備得到的包埋植物乳桿菌T17的AL、ALC、EA 和EAC 顆粒在凍干前和凍干后進(jìn)行單位質(zhì)量菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。每種樣品取10 顆稱(chēng)重，加入10 mL 生理鹽水，均質(zhì)分散，使植物乳桿菌充分釋放出來(lái)，稀釋后加入MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。將凍干后的菌粉、ALC和EAC 儲(chǔ)存于4 ℃和-20 ℃條件下，每隔7 d 取樣測(cè)定菌量。

按照Li 等[10]的方法進(jìn)行模擬胃腸液的制備。模擬胃液：NaCl 8.5 g/L，胃蛋白酶3 g/L，用1 mol/L HCl 調(diào)整pH 值為2.0，0.45 μm 濾膜過(guò)濾除菌備用。取加入100 μL 原菌液或者10 顆上述 （圖1）制備的顆粒加入到10 mL 的人工胃液中，37℃、200 r/min 振蕩厭氧培養(yǎng)2 h 模擬胃液消化后測(cè)定植物乳桿菌菌量，計(jì)算模擬胃液消化存活率。

將100 μL 原菌液或者10 顆上述（圖1）制備的顆粒加入到10 mL 的人工胃液中，37 ℃200 r/min 振蕩厭氧培養(yǎng)2 h 后加入100 μL 1 mol/L NaHCO3使體系pH 值為7.0。加入100 μL 300 g/L的膽酸和100 μL 100 g/L 的胰蛋白酶，37 ℃、200 r/min 振蕩厭氧培養(yǎng)4 h 模擬腸道消化后測(cè)定植物乳桿菌菌量，計(jì)算模擬胃腸液消化存活率。按照公式（1）計(jì)算存活率。

式中，N0——處理前的活菌菌落數(shù)，CFU/mL；N1——用人工胃腸液處理過(guò)的活菌菌落數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子相互作用分析

圖2a 為海藻酸鈉、殼聚糖和乳清分離蛋白的紅外光譜圖，圖2b 為海藻酸鈉氣凝膠（AL）、海藻酸鈉/殼聚糖氣凝膠（ALC）、乳液模板海藻酸鈉氣凝膠（EA）和乳液海藻酸鈉/殼聚糖氣凝膠（EAC）紅外光譜圖。圖2a 中海藻酸鈉紅外光譜中3 405 cm-1處的寬吸收峰是由-OH 伸縮振動(dòng)引起的，2 933 cm-1處的吸收峰是C-H 伸縮振動(dòng)引起的。1 616 cm-1和1 413 cm-1處的吸收峰是海藻酸鈉結(jié)構(gòu)中對(duì)稱(chēng)的-COONa 伸縮振動(dòng)引起的，1 120，1 140，1 030 cm-1處的吸收峰是C-O-C 的彎曲振動(dòng)峰。殼聚糖在1 651，1 593，1 419，1 378，1 155 cm-1處存在特征吸收峰。圖2b 中AL 的紅外光譜與海藻酸鈉原料接近，但是吸附殼聚糖后ALC 的特征峰發(fā)生了較大變化，代表-OH 振動(dòng)的峰強(qiáng)減弱，當(dāng)海藻酸鈉1 616 cm-1和1 413 cm-1處的特征峰減小時(shí)，說(shuō)明殼聚糖NH3+和海藻酸鈉COO-之間發(fā)生了靜電相互作用，使得-COONa 特征峰基團(tuán)減弱發(fā)生偏移[11]。以乳液為模板的海藻酸鈉氣凝膠（EA）未進(jìn)行殼聚吸附時(shí)紅外光譜就發(fā)生了較大變化，與ALC 峰形類(lèi)似，說(shuō)明海藻酸鈉與乳清分離蛋白發(fā)生了靜電相互作用。經(jīng)過(guò)了殼聚糖吸附后EAC 的紅外光譜中觀察到了殼聚糖在1 575 cm-1和1 417 cm-1處的特征峰。

圖2 樣品紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of samples

2.2 氣凝膠形態(tài)

從圖3中可以看出，以乳液為模板的顆粒不透明度更高，這是由于顆粒中乳液液滴分散的緣故。進(jìn)行殼聚糖吸附之前AL 與EA 凍干前、后顆粒的形態(tài)差異不大，而凍干后ALC 的形態(tài)多為不規(guī)則顆粒，并且破碎較多，這可能是由于凍干過(guò)程中顆粒結(jié)構(gòu)不致密，引起顆粒皺縮嚴(yán)重甚至破裂。凍干后，以乳液為模板的EAC 氣凝膠顆粒形狀接近球狀，相比于未吸附殼聚糖的EA 形態(tài)差異不大。

圖3 AL、ALC、EA 和EAC 氣凝膠凍干前（a）和凍干后（b）照片F(xiàn)ig.3 The photo of the AL，ALC，EA，and EAC aerogel before （a） and after （b） freeze drying

通過(guò)掃描電子顯微鏡 （圖4a 和4b） 觀察發(fā)現(xiàn)，氣凝膠在冷凍過(guò)程中發(fā)生了收縮，表面形成了皺縮，未進(jìn)行殼聚糖吸附的AL 和EA 的氣凝膠顆粒表面較為光滑，而進(jìn)行了殼聚糖吸附的ALC 和EAC 氣凝膠表面較為粗糙。ALC 相比于EAC 表面更為粗糙，并且觀察到了更多的破裂顆粒，說(shuō)明以乳液為模板層層自組裝得到的氣凝膠形態(tài)更為良好。表面未觀察到植物乳桿菌，表明植物乳桿菌被包埋于氣凝膠內(nèi)部[12]。通過(guò)生物制樣后觀察氣凝膠內(nèi)部發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌被海藻酸鈉包裹（圖4c）。

圖4 AL、ALC、EA 和EAC 氣凝膠凍干后電鏡圖Fig.4 The SEM images of AL，ALC，EA，and EAC after freeze drying

2.3 貯藏及消化穩(wěn)定性

表1為冷凍干燥前、后ALC 和EAC 包埋的植物乳桿菌T17 的菌量，ALC 和EAC 凍干后菌株存活率分別為87.6%和92.3%，說(shuō)明以乳液為模板包埋的植物乳桿菌的凍干穩(wěn)定性相對(duì)較好。

表1 冷凍干燥前、后ALC 和EAC 中植物乳桿菌存活率Table 1 The livability of the Lactobacillus plantarum T17 in ALC and EAC before and after freeze drying

為了評(píng)價(jià)ALC 和EAC 植物乳桿菌氣凝膠的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，將其和凍干菌粉在4 ℃和-20 ℃條件下存儲(chǔ)5 周，菌落總數(shù)變化如圖5所示。隨著存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)，凍干菌粉中的菌落總數(shù)不斷下降，4 ℃和-20 ℃條件下均下降明顯。ALC 和EAC 包埋的植物乳桿菌菌量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)幾乎無(wú)變化，說(shuō)明ALC 和EAC 包埋的植物乳桿菌具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。徐鵬翔等[13]通過(guò)銀杏蛋白和海藻酸鈉制備的包埋植物乳桿菌的微膠囊在4 ℃儲(chǔ)存30 d后菌落總數(shù)從8 lg（CFU/g）降低至3.31 lg（CFU/g）。姚澤晨等[14]以阿拉伯木聚糖和海藻酸鈉制備的微膠囊包埋植物乳桿菌，在4 ℃和-20 ℃條件下7 周后菌落數(shù)分別下降了1.71 lg （CFU/g） 和1.2 lg（CFU/g）。

圖5 植物乳桿菌T17 在ALC 和EAC 氣凝膠以及菌粉中的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.5 The viability of the Lactobacillus plantarum T17 in ALC，EAC and powder

表2為乳液和非乳液模板的海藻酸鈉-殼聚糖氣凝膠中植物乳桿菌T17 經(jīng)胃腸液消化后存活率，原菌液在胃液消化2 h 后存活率僅為56.8%，再經(jīng)過(guò)4 h 腸液消化后未檢測(cè)到存活的植物乳桿菌T17。ALC 和EAC 經(jīng)過(guò)2 h 胃液消化后存活率都達(dá)到90%以上，說(shuō)明以乳液為模板包埋植物乳桿菌T17 對(duì)于其胃液穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響。單組分的海藻酸鈉氣凝膠對(duì)益生菌的包埋效果不佳，胃腸道穩(wěn)定性不高。本研究中采用殼聚糖進(jìn)行層層自組裝后得到的氣凝膠能夠有效抵抗胃液的滲透，胃液穩(wěn)定性較好。再經(jīng)過(guò)4 h 腸液消化后ALC和EAC 中植物乳桿菌T17 的存活率分別為60%和53.1%。Gbassi 等[15]研究發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉顆粒外吸附一層乳清分離蛋白能夠顯著提升其包埋的植物乳桿菌胃腸道消化穩(wěn)定性。通過(guò)層層自組裝靜電吸附殼聚糖到海藻酸鈉顆粒上能夠降低胃腸液對(duì)其滲透性，從而表現(xiàn)出較好的消化穩(wěn)定性。

表2 ALC、EAC 和原菌液中植物乳桿菌經(jīng)過(guò)模擬胃腸液消化后的存活率Table 2 The viability of the Lactobacillus plantarum T17 in ALC，EAC and original medium after simulated gastric and intestinal digestion

3 結(jié)論

本研究采用層層自組裝的方法制備了以非乳液和乳液為模板的海藻酸鈉/殼聚糖氣凝膠顆粒包埋酸面團(tuán)來(lái)源的植物乳桿菌。結(jié)果表明：以乳液為模板的顆粒中海藻酸鈉與乳清分離蛋白之間發(fā)生了較強(qiáng)的靜電相互作用，殼聚糖通過(guò)靜電相互作用吸附在海藻酸鈉顆粒上。乳液模板的海藻酸鈉/殼聚糖氣凝膠具有更好的凍干穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。非乳液和乳液模板的氣凝膠對(duì)植物乳桿菌的消化穩(wěn)定性有顯著提升，二者沒(méi)有明顯差異。