楊寶雨，趙軍英，喬為倉(cāng)，張明輝，劉彥品，侯俊財(cái)，陳歷俊*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150030 2 北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)中心 北京 100163）

母乳是新生兒生命第1 階段的唯一營(yíng)養(yǎng)源，被視為嬰幼兒營(yíng)養(yǎng) “金標(biāo)準(zhǔn)”。其中母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide，HMOs）是母乳的主要成分，因不易被人體胃、腸道消化，而在營(yíng)養(yǎng)方面被忽視多年。然而，有研究表明，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，使HMOs 具有重要的生理功能[1-3]。它可以通過(guò)補(bǔ)充益生元，黏附[4]、模擬腸道上皮細(xì)胞結(jié)合配體[5-6]，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多種形式干擾有害物質(zhì)與宿主的相互作用，從而影響新生兒健康狀況[7]。

由于HMOs 無(wú)法大規(guī)模模擬，因此在嬰幼兒配方奶粉中添加的低聚糖主要是低聚半乳糖（Galactooligosacchari-des，GOS）和低聚果糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）。Tungland 等[8]對(duì)GOS進(jìn)行了全面的綜述，β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的GOS僅由半乳糖和葡萄糖單元構(gòu)成，不含HMOs 和牛乳低聚糖（Bovine milk oligosaccharide，BMOs）中典型的巖藻糖和唾液酸結(jié)構(gòu)。2016年后，部分高純單體HMOs 分子，如2'-巖藻糖基乳糖（2'-Fucosyllactose，2'-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化模擬。雖然人體初步試驗(yàn)證明，2'-FL與嬰兒配方奶粉中的其它低聚糖結(jié)合食用具有安全性和潛在的健康益處[9-11]，但僅模擬了HMOs 中一種或幾種分子結(jié)構(gòu)。迄今為止，還未從任何動(dòng)物乳汁中提取復(fù)合低聚糖作為商業(yè)來(lái)源。Tao 等[12]發(fā)現(xiàn)BMOs 在結(jié)構(gòu)上與HMOs 相似，可作為一種與HMOs 生物學(xué)功能相近的代替營(yíng)養(yǎng)源。通過(guò)膜分離技術(shù)分離富集BMOs，不僅能保持它的天然結(jié)構(gòu)，而且具有易操作、無(wú)相變和節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。在工業(yè)生產(chǎn)上使用膜分離技術(shù)提取BMOs 是可行的[13]。

本文從HMOs 的含量、分型、結(jié)構(gòu)特征、檢測(cè)方法、生理功能、消化吸收、模擬以及潛在代替品8 個(gè)方面綜述研究進(jìn)展，旨在為HMOs 的研究、模擬、替代和商業(yè)化應(yīng)用提供理論參考。

1 母乳低聚糖的含量及分型

HMOs 數(shù)量和組成在不同個(gè)體和哺乳期之間各不相同[14]。初乳一般是分娩后3～7 d 內(nèi)乳腺分泌的黏稠狀淡黃色液體，HMOs 質(zhì)量濃度高達(dá)20～25 g/L[15]。15 d 后過(guò)渡為成熟乳，此時(shí)HMOs 質(zhì)量濃度下降至5～20 g/L[16]，但仍比BMOs 高100～1 000倍。在牛乳基或羊乳基嬰幼兒配方奶粉中BMOs和羊乳低聚糖（Caprine milk oligosaccharide，CMOs）均小于1 g/L[17]。由表1可知，母乳中巖藻糖基化HMOs 較高，其它哺乳動(dòng)物則相反。CMOs含量雖然高于BMOs，但奶山羊泌乳量較低。此外，HMOs 質(zhì)量濃度的巨大波動(dòng)還反映了不同母親之間以及不同實(shí)驗(yàn)室使用的非標(biāo)準(zhǔn)分析方法的差異。

表1 成熟母乳、牛乳和山羊乳中的宏量元素和低聚糖比較[12，15，18-22]Table 1 Macronutrients and oligosaccharides in mature human，bovine and caprine milk[12，15，18-22]

HMOs 的組成還反映Lewis 表型和ABH 分泌狀態(tài)。這主要取決于Se 基因編碼的α-1-2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT 2）和Le基因編碼的α-1，3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase 3，F(xiàn)UT3）[23]。具有活性Se 位點(diǎn)的個(gè)體被歸類(lèi)為分泌型，其母乳中含有豐富的2′-FL、乳酰-N-巖藻五糖I（Lacto-N-fucopentaose I，LNFP I）和其它α-1-2-巖藻糖基HMOs。與之相比，非分泌型則缺乏FUT 2，即不含α-1-2-巖藻糖基HMOs。具有活性L(fǎng)e 位點(diǎn)的個(gè)體被歸為L(zhǎng)e 陽(yáng)性。其表達(dá)FUT 3，即α-1-4-巖藻糖基HMOs 轉(zhuǎn)移至N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）的亞末端[24-25]（圖1）。相反，Le 陰性母親的母乳缺乏這些特異性α-1-4-巖藻糖基化HMOs，如乳糖-N-巖藻五糖II （Lacto-N-fucopentaose II，LNFP II）。根據(jù)表型和分泌狀態(tài)，母乳可分為4 種類(lèi)型：Lewis 陽(yáng)性分泌型（Se+Le+）、Lewis 陽(yáng)性非分泌型（Se-Le+）、Lewis 陰性分泌型（Se+Le-）和Lewis 陰性非分泌型（Se-Le-）。這4 組的母乳個(gè)體樣品分類(lèi)只不過(guò)是HMO 復(fù)雜性的過(guò)度簡(jiǎn)化，其它與Se和Le 無(wú)關(guān)的FUTs（FUT4、5、6、7 或9）也可能參與其中[4]。除了這些基因變異，其它因素也可能影響HMOs 的數(shù)量和組成，如營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境等方面。

圖1 Se、Le 基因與HMOs 類(lèi)型[25]Fig.1 Se，Le genes and HMOs types[25]

2 HMOs 結(jié)構(gòu)及組成

2.1 HMOs 單體、核心系列和糖苷鍵

HMOs 結(jié)構(gòu)具有多樣性。在個(gè)體和哺乳期間，濃度和成分具有很大差異[26]。它們以游離、糖蛋白或糖脂等形式出現(xiàn)[27]。如表2所示，HMOs 結(jié)構(gòu)主要由5 中單體組成，而B(niǎo)MOs 多了一個(gè)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-Hydroxyacetylneuraminic acid，NeuGc）單體，其中5%的酸性低聚糖含有NeuGc[28]。HMOs 中NeuGc 的缺乏，可能是由于300 萬(wàn)年前，原始人的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的突變?cè)斐傻腫29]。每個(gè)HMOs 均以乳糖殘基為核心，通過(guò)β-1，3 糖苷鍵或β-1，6 糖苷鍵連接乳糖-N-二糖或N-乙酰乳糖胺單元延伸成直鏈（類(lèi)型Ⅰ）或支鏈結(jié)構(gòu)（類(lèi)型Ⅱ）。乳糖、短鏈線(xiàn)性或支鏈結(jié)構(gòu)，在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過(guò)α-1，2，α-1，3 或α-1，4 糖苷鍵延伸成巖藻糖基化寡糖或α-2，3，α-2，6 糖苷鍵延伸成唾液酸化寡糖[30]（圖2）。而B(niǎo)MOs 主要以乳糖、乳糖胺為核心。目前，只有7 個(gè)含有乳糖胺核心的BMOs 被報(bào)道[31]。同時(shí)，BMOs 還存在一個(gè)半乳糖與乳糖以β-1，3 或β-1，6 糖苷鍵相連的三糖核心，但豐度較低（圖2）[32-33]。此外，植物源中的組成單體種類(lèi)較多（表2），分別由一系列半乳糖和果糖單體聚合成線(xiàn)性結(jié)構(gòu)（圖3）[28]。除葡萄糖和半乳糖單體之外，不存在與乳源低聚糖相同的組成單體。因此，植物源低聚糖可能只具備復(fù)雜HMOs 和BMOs 的部分功能。

圖2 低聚糖延長(zhǎng)方式Fig.2 Oligosaccharide elongation mode

表2 母乳低聚糖、牛乳低聚糖及植物源低聚糖組成單體比較Table 2 The composition monomer of HMOs，BMOs and plant-derived oligosaccharides

圖3 母乳低聚糖、牛乳低聚糖、低聚半乳糖、低聚果糖和菊粉的結(jié)構(gòu)比較[28]Fig.3 Structure comparison of HMOs，BMOs，GOS，F(xiàn)OS and inulin[28]

除乳糖外，母乳中還存在大約1 000 種HMOs分子[34]，大多數(shù)以少量出現(xiàn)。根據(jù)HMOs 的結(jié)構(gòu)特性，將其大約分為17 種中性低聚糖核心結(jié)構(gòu)[35-38]（表3）。此外，如表4所示，12 種糖苷鍵也豐富了HMOs 的結(jié)構(gòu)。主要包括3 種半乳糖苷鍵、2 種N-乙酰氨基葡萄糖苷鍵、4 種巖藻糖苷鍵和3 種唾液酸糖苷鍵。總之，HMOs 的多樣性受不同糖單元（表2）、聚糖長(zhǎng)度、大小、核心序列（表3）和12 種糖苷鍵的影響（表4）[4]。

表3 乳糖和可作為其它HMOs 核心結(jié)構(gòu)的中性非巖藻糖基HMOsTable 3 Lactose and neutral non-fucosyl HMOs that can serve as the core structure of other HMOs

（續(xù)表3）

表4 構(gòu)成不同HMOs 的12 個(gè)糖苷鍵[23，40]Table 4 Twelve glycosidic linkages that constitute diverse HMOs[23，40]

（續(xù)表4）

2.2 HMOs 的結(jié)構(gòu)表征

HMOs 組分極其復(fù)雜，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)200種HMOs[32，50]，已經(jīng)分離和鑒定了至少157 種不同的HMOs 結(jié)構(gòu)[23，42]。而B(niǎo)MOs 和CMOs 僅鑒定出50種[51]。成分識(shí)別和結(jié)構(gòu)鑒定需通過(guò)一種或多種組合技術(shù)實(shí)現(xiàn)，主要包括氚標(biāo)記、熒光衍生化、甲基化、糖苷酶消化、1H 和13C 核磁共振波譜表征（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)（High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）和質(zhì)譜（Mass spectrometric，MS）技術(shù)等[52]。如表5所示，母乳中巖藻糖基化低聚糖含量占比較高，約占母乳中總低聚糖的70%，其中2′-FL 高達(dá)4.65 g/L[10]。與HMOs 相比，BMOs 中唾液酸化低聚糖含量較高。至少存在15 種BMOs 和CMOs 與HMOs 具有相同的結(jié)構(gòu)（表5），即具有相同的功能[53]。因此，從其它哺乳動(dòng)物乳汁中提取低聚糖，將其作為活性物質(zhì)添加到嬰幼兒配方奶粉中具有重要價(jià)值。此外，BMOs 的聚合度通常比HMOs 小，主要由三糖和四糖組成，最高為7 聚體，而HMOs 中最高可達(dá)15 聚體。

表5 HMOs 和BMOs 共有的結(jié)構(gòu)Table 5 Common structure between BMOs and HMOs

（續(xù)表5）

3 母乳低聚糖的檢測(cè)方法

HMOs 具有重要的生物學(xué)功能，由于它的復(fù)雜性，其表征技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于核酸和蛋白質(zhì)技術(shù)。即使了解了HMOs 的序列，仍不能對(duì)其進(jìn)行完整的表征。例如：連接2 個(gè)環(huán)己糖的糖苷鍵，可以通過(guò)5 種羥基中的任一種實(shí)現(xiàn)（圖4）[65]。此外，還存在糖基化現(xiàn)象。因此還必須確定鏈的長(zhǎng)度、立體化學(xué)結(jié)構(gòu)和分支度。分支易發(fā)生在低聚糖中，很少在多肽或蛋白質(zhì)中出現(xiàn)。例如：氨基酸在蛋白質(zhì)的主鏈中只有一種連接方式（酰胺鍵）。傳統(tǒng)上主要是通過(guò)甲基化、特異性?xún)?nèi)切糖苷酶、外切糖苷酶、凝膠過(guò)濾、紙層析、薄層層析、CE、HPLC、HPAECPAD、NMR 等多種技術(shù)相結(jié)合的方式對(duì)乳低聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。然而，這些方法通常需要超過(guò)1 mg 的低聚糖樣品[66]，對(duì)低濃度HMOs 和BMOs 研究是一個(gè)限制。近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解吸（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、電噴霧（Electrospray ionization，ESI）解吸離子化以及碰撞誘導(dǎo)離子化（Collision induced dissociation，CID）等電離技術(shù)使高分辨率質(zhì)譜（飛行時(shí)間質(zhì)譜、四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜等）在低聚糖研究方面取得了重大突破。此外，Wu 等[20]還引入納升液相色譜-芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜來(lái)分析HMOs，結(jié)果表明其對(duì)異構(gòu)體具有良好的分離效果。目前，主要的檢測(cè)方法，如表6所示。

圖4 環(huán)己糖結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of hexos

獻(xiàn)文考參[67][68][23][69][20]，[36]，[50][32]，，[70][48][71]，[72][7][73][74]，[76][75]，[77][16]，[80][78]法方測(cè)檢糖聚低乳母用常6表Methods of detection of human milk oligosaccharides Table 6 價(jià)評(píng)法方劑試生衍備設(shè)測(cè)檢的化基糖藻巖或化酸液唾被15 個(gè)定測(cè)時(shí)同可項(xiàng)一了立建胺酰甲苯基2-氨譜色相液率辨分0.999于高數(shù)系關(guān)，相性線(xiàn)的好良和度敏靈高有HMOs，具哺了察，觀(guān)異差量含的HMOs種12中品樣乳母同不定測(cè)過(guò)通-譜質(zhì)聯(lián)串相化變的HMOs期乳化變的天90第到天3第后產(chǎn)從在HMOs種20和糖乳了定測(cè)-培安沖脈-譜色換交子離陰效在兒生新和量總糖聚低乳母了析，分糖聚低要主種18了量定-培安沖脈-譜色換交子離陰效系聯(lián)的間之成組群物生微便糞的內(nèi)月個(gè)1第后生出型泌分和型Lewis 血括包，還庫(kù)據(jù)HMOs 數(shù)性中45 個(gè)了立建-子離霧噴-電譜色相液效高升HMOs 別識(shí)速快于用，可息信等譜質(zhì)間時(shí)行-飛圖譜質(zhì)的品樣乳母同不位5對(duì)，并構(gòu)結(jié)HMOs種余200了現(xiàn)發(fā)-譜質(zhì)-片芯-譜色相異差在存分成HMOs間之體個(gè)同不現(xiàn)，發(fā)較比了行進(jìn)構(gòu)結(jié)HMOs的基糖藻巖同不個(gè)74了析解下式模子離負(fù)-時(shí)行飛-離電吸解光激助輔質(zhì)譜質(zhì)上床臨在2'-FL的中HMOs明表，并HMOs的要主種8了測(cè)檢化酰甲苯譜色相液效高相關(guān)有瀉腹兒嬰防預(yù)與2'-FL、LDFT 和出，得化變量HMOs 含10 種的中乳初了定測(cè)-5-基-3-甲基1-苯譜色相液效高相感抗和元生益對(duì)期早乳哺在兒嬰了映反能可化變的度LNT 濃吡基、2-氨酮啉唑吡求需的物藥染啶性中要主種9的中乳母100 d和，30 d，10 4后產(chǎn)了定測(cè)啶吡基氨2-譜色相液效高相的HMOs性中總占糖聚低些，這中乳熟成和乳初，在HMOs 73%HMOs性中種11了定，測(cè)法方生衍的酸甲苯基氨鄰進(jìn)改過(guò)通酸甲苯基氨2-譜色相液效高相，發(fā)異差糖聚低乳母的區(qū)地個(gè)2了較比。并HMOs性酸種6和遺是能可測(cè)，推異差著顯現(xiàn)出HMOs性，中似相HMOs性酸現(xiàn)因原的傳唾察觀(guān)于用，適HMOs酸液唾要主種12了量定時(shí)同內(nèi)35 min法譜色管細(xì)毛動(dòng)電束系關(guān)的險(xiǎn)風(fēng)病疾定特兒嬰低降對(duì)化變達(dá)表HMOs 的酸液的中胃腸在HMOs測(cè)，監(jiān)HMOs種10的內(nèi)月個(gè)6后產(chǎn)了定測(cè)，6-，3-1基芘基氨8-泳電管細(xì)化變酸磺三高液高高納阱液基間反反反反膠毛柱譜色ACQUITY UPLC BEH Amide Amino Column CarboPac PA-100 CarboPac PA-1 Porous Graphitic Carbon-Chip Hypercarb Porous Graphitized Carbon column Hypercarb Porous Graphitized Carbon Column Rainin C-8 Inertsil ODS-3V and ODS-100Z Inertsil ODS-3V TSKgeODS-100Z--

4 HMOs 的功能

從母乳中提取的HMOs 混合物常用來(lái)進(jìn)行功能研究，然而沒(méi)有足夠數(shù)量的純HMOs，因此單個(gè)HMOs 的功能作用尚不清楚。母乳喂養(yǎng)的益處早在19世紀(jì)末就已被觀(guān)察到[25]，最初HMOs 被認(rèn)為具有“雙歧因子”作用。但自20世紀(jì)90年代初以來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，HMOs 不僅僅是促進(jìn)嬰兒腸道內(nèi)微生物菌群生長(zhǎng)的基質(zhì)，還具有以下功能：

4.1 益生元

HMOs 不易被上消化道消化吸收，能完整到達(dá)結(jié)腸，可為結(jié)腸細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和能量。在厭氧條件下，選擇性的被雙歧桿菌和擬桿菌等益生菌利用（圖5），產(chǎn)生后生元和短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs），如乙酸、丙酸和丁酸等物質(zhì)。此外，較低pH 值的腸道微環(huán)境也不利于有害菌群的生長(zhǎng)（梭狀芽胞桿菌、腸球菌、真細(xì)菌和腸桿菌等），從而發(fā)揮益生元作用[81-83]。

當(dāng)在無(wú)菌小鼠體內(nèi)接種泰奧他米克龍類(lèi)桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）后，LNnT 與飲用水一起灌胃，嬰兒雙歧桿菌相對(duì)豐度增加到40%以上[84]，而泰奧他米克龍類(lèi)桿菌無(wú)顯著變化；然而當(dāng)LNnT 不在飲食中時(shí)，嬰兒雙歧桿菌的相對(duì)豐度僅為2%左右，說(shuō)明LNnT 為嬰兒雙歧桿菌生長(zhǎng)提供了優(yōu)勢(shì)。

BMOs 作為益生元的研究較少，Jakobsen等[85]比較了BMOs 和GOS 對(duì)8 種主要嬰兒腸道細(xì)菌的單一和共培養(yǎng)的影響，結(jié)果顯示BMOs 具有促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種（B.longum ssp.longum）和吉氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis）生長(zhǎng)，抑制產(chǎn)氣莢膜桿菌（Clostridium perfringen）和大腸桿菌（Escherichia coli.）的作用。Ward 等[86]將BMOs 和HMOs 分別作為嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵底物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加BMOs 的嬰兒雙歧桿菌生長(zhǎng)狀況優(yōu)于HMOs 的效果，可能是嬰兒雙歧桿菌易消耗聚合度小于7 的化合物，而B(niǎo)MOs 聚合度小于HMOs。因此，BMOs 也是嬰兒雙歧桿菌的良好食物來(lái)源[87]。

4.2 抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)作用

腸黏膜具有較大的表面積，也是糖基化程度最高的組織之一[88]。覆蓋著復(fù)雜的聚糖，包括低聚糖、糖蛋白、糖脂和黏蛋白等[89]。其中HMOs 的主要功能被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境，包括細(xì)胞間通訊、分子識(shí)別和屏障功能等。細(xì)菌和病毒感染的第1 步是識(shí)別和結(jié)合腸黏膜上特定細(xì)胞的表面聚糖[90]。唾液酸化和巖藻糖基化低聚糖含有與這些聚糖類(lèi)似的結(jié)構(gòu)單元。因此HMOs 可以作為受體類(lèi)似物，抑制病原體的黏附，從而防止感染（圖5）[91]。諾如病毒或輪狀病毒是嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最常見(jiàn)原因之一[92]，每年造成近50 萬(wàn)人死亡[93]。研究發(fā)現(xiàn)，α-1，2-巖藻糖基化HMOs 對(duì)減少空腸彎曲菌相關(guān)性腹瀉起有益作用，已在墨西哥市100 對(duì)母嬰的前瞻性研究中得到證實(shí)[7]。Morrow 等[7]在93對(duì)母嬰研究中，收集了2年內(nèi)嬰兒喂養(yǎng)和腹瀉數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)母乳中的2′-FL 和乳糖-N-二巖藻糖與嬰兒彎曲桿菌和杯狀病毒腹瀉的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。因此，HMOs 分子可以與病毒結(jié)合并降低感染風(fēng)險(xiǎn)[94]。

此外，抗黏附、抗菌作用不僅適用于細(xì)菌和病毒，也可能適用于原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)，如溶組織內(nèi)阿米巴。全世界大約5 000 萬(wàn)人感染了溶組織內(nèi)阿米巴，導(dǎo)致阿米巴痢疾或阿米巴肝膿腫，每年造成近10 萬(wàn)人死亡，成為寄生蟲(chóng)病第三大死因，僅次于瘧疾和血吸蟲(chóng)病[95]。Jantscher-krenn 等[96]表明溶組織內(nèi)阿米巴的主要毒力因子之一是HMOs 中的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺特異性凝集素，有助于腸上皮細(xì)胞的殺傷和吞噬作用。Urakami 等[97]以HMOs 為陽(yáng)性對(duì)照，比較了BMOs 和CMOs 對(duì)腸道沙門(mén)菌ⅡD604（S.enterica IID604）與Coao-2 細(xì)胞的黏附抑制作用。Maldonado-Gomez 等[98]在體外試驗(yàn)中，證明了BMOs 可以阻止致病性大腸桿菌、阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）和鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhymurium）與Hep-2 細(xì)胞的黏附作用。Leong 等[99]發(fā)現(xiàn)CMOs 能夠阻止大腸桿菌NCTC10418 和鼠傷寒沙門(mén)氏菌與Caco-2 細(xì)胞的黏附，為HMOs、BMOs 和CMOs 作為潛在抗感染劑提供了有力的證據(jù)。

4.3 腸上皮細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)因子

HMOs 中的唾液酸可以附著在腸上皮細(xì)胞上，直接影響誘導(dǎo)差異基因表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)（圖5）。因此，當(dāng)HMOs 存在時(shí)，腸致病性大腸桿菌與腸上皮細(xì)胞的結(jié)合明顯減少[100]。Kuntz 等[101]通過(guò)改變與生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞周期基因，證實(shí)了HMOs 可以抑制腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其分化和凋亡。仍需進(jìn)一步研究以確定HMOs 用來(lái)觸發(fā)差異基因表達(dá)的受體和信號(hào)通路途徑。Kuntz 等[102]研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和Ras / Raf / ERK 信號(hào)通路可能參與其中，但HMOs 是直接與EGFR 相互作用，還是間接調(diào)節(jié)EGFR 的信號(hào)仍尚待確定。3′SL 是BMOs 的主要成分，現(xiàn)有證據(jù)表明它可以調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞表面的多糖，從而減少或增加細(xì)菌的附著位點(diǎn)[100]。Alicia 等[103]通過(guò)CMOs 與Caco-2/HT29-MTX 腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其增加了腸上皮細(xì)胞的跨上皮電阻、黏蛋白基因表達(dá)和黏蛋白蛋白豐度?？傊?，HMOs、BMOs 和CMOs 成分均可以直接調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞。

4.4 免疫調(diào)節(jié)劑

根據(jù)觀(guān)察到的血液、尿和糞便情況，發(fā)現(xiàn)少量的HMOs 可能從胃腸道吸收并進(jìn)入全身循環(huán)[104]。當(dāng)臍血T 細(xì)胞與唾液酸化HMOs 接觸時(shí)，會(huì)增加產(chǎn)生干擾素-γ 的CD3+、CD4+和CD3+、CD8+淋巴細(xì)胞以及產(chǎn)生白細(xì)胞介素-13 （Interleukin-13，IL-13）的CD3+、CD8+淋巴細(xì)胞[105]。這項(xiàng)研究推測(cè)，唾液酸化的HMOs 影響淋巴細(xì)胞成熟，促進(jìn)T 細(xì)胞向更平衡的Th1/Th2 細(xì)胞因子生產(chǎn)轉(zhuǎn)變。Velupillai 等[106]在小鼠感染模型中發(fā)現(xiàn)，富含HMOs 的乳糖-新四糖結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)產(chǎn)生白細(xì)胞介素10（Interleukin 10，IL 10），Tao 等[12]在成熟牛乳中也檢測(cè)到相同的結(jié)構(gòu)。BMOs 在免疫調(diào)節(jié)方面的研究較少，Martín 等[107]以7 種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株為研究對(duì)象，研究了BMOs 對(duì)血液毒性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)BMOs 可以作為抗感染劑用于人類(lèi)和奶牛。此外，HMOs 的組成在個(gè)體之間不同，意味著不同母親的母乳對(duì)嬰兒免疫系統(tǒng)的影響不同，從而導(dǎo)致嬰兒患過(guò)敏、哮喘或其它與免疫系統(tǒng)有關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)不同。此外，Eiwegger 等[108]研究發(fā)現(xiàn)唾液酸化的HMOs 會(huì)減少花生過(guò)敏患者淋巴細(xì)胞亞群中IL-4 的產(chǎn)生，有助于預(yù)防過(guò)敏。以上研究表明，HMOs 和BMOs 均可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)保護(hù)新生兒。

4.5 神經(jīng)發(fā)育

含有NeuAc 結(jié)構(gòu)的低聚糖可以促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育[109]。人體雖然可以從肝臟中合成NeuAc，但嬰幼兒時(shí)期，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-表異位酶的活性較低，可能存在發(fā)育能力超過(guò)合成能力的現(xiàn)象。出生前幾個(gè)月到出生后幾年之間，大腦中的唾液酸濃度增加了一倍以上。大腦的發(fā)育和認(rèn)知在一定程度上依賴(lài)含有神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸和含有糖蛋白的多聚唾液酸[110]（圖5）。Wang等[111]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加唾液酸化的酪蛋白糖巨肽時(shí)，仔豬的學(xué)習(xí)和記憶能力增強(qiáng)。Sakai 等[112]通過(guò)給成年大鼠飼喂唾液酸乳糖后，發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)節(jié)苷脂和游泳能力的都得到了提高。此外，Vázquez 等[113]通過(guò)研究表明，嚙齒動(dòng)物攝入2'-FL 可改善學(xué)習(xí)和記憶能力。Wang 等[114]通過(guò)對(duì)新生兒的尸檢分析表明，母乳喂養(yǎng)的嬰兒大腦中神經(jīng)節(jié)苷脂唾液酸和含有糖蛋白的多聚唾液酸濃度明顯高于配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒。因此，唾液酸低聚糖添加到嬰幼兒配方或其它功能性食品中，可以作為大腦激活因子。

4.6 對(duì)乳母的保護(hù)作用

母乳并非無(wú)菌，其含有復(fù)雜的菌群，且個(gè)體之間差異較大[115]。母乳中的細(xì)菌可以接種到嬰兒腸道，也可以被視為調(diào)節(jié)母乳成分的潛在共生菌或?qū)е氯橄傺椎燃膊〉牟≡w。到目前為止，母乳低聚糖的潛在益處大都與母乳喂養(yǎng)的嬰兒有關(guān)。然而，母乳低聚糖也可能影響乳母，其潛在機(jī)制可能類(lèi)似（圖5），即HMOs 可作為益生元或抗菌劑影響乳腺中的葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、乳酸桿菌和腸球菌等細(xì)菌或直接調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞應(yīng)答和局部免疫反應(yīng)[25]。葡萄球菌是造成乳腺炎的一個(gè)主要原因[116]。Lane 等[117]基于生物傳感器的快檢方法，發(fā)現(xiàn)部分葡萄球菌菌株可以與HMOs 中的2′-FL 結(jié)合，然而是否可以降低乳腺炎風(fēng)險(xiǎn)尚不清楚。此外，Hallgren 等[118]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在妊娠期孕婦的尿液中檢測(cè)到了HMOs。因此，HMOs 不僅對(duì)嬰兒有重要的生理功能，而且對(duì)乳母也有潛在的益生元和抗菌作用。

圖5 HMOs 的功能[91]Fig.5 Functions of HMOs[91]

5 消化和吸收特性

嬰兒缺乏水解或消化HMOs 所必需的酶，使得HMOs 能夠抵抗胃酸、胰酶和刷狀緣酶的降解，從而進(jìn)入結(jié)腸[119-120]。因此，從嚴(yán)格意義上說(shuō)，HMOs不是嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)素，而是膳食纖維的一種。大約1%的HMOs 被吸收并在全身循環(huán)，它們很可能到達(dá)腸道以外的許多器官，包括肝臟和大腦，以及呼吸道和泌尿道，而后隨尿液以完整或部分降解的形式排出[121-122]。而大多數(shù)的HMOs 被腸道微生物代謝或隨糞便排出[78-79]。因此，母乳低聚糖的生物學(xué)功能可能不局限于腸道，也可能會(huì)在新生兒多個(gè)不同水平上影響嬰兒。

6 HMOs 的模擬與應(yīng)用

HMOs 在嬰兒身體健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[123]。受限于原料來(lái)源和倫理問(wèn)題，導(dǎo)致HMOs 大多不存在于嬰兒配方奶粉中。此外，牛乳中天然BMOs 含量較低，其開(kāi)發(fā)仍處于初級(jí)階段。因此，通常把GOS 和FOS 添加到嬰幼兒配方奶粉中，以期達(dá)到與母乳喂養(yǎng)相似的腸道菌群。GOS 是由乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶催化形成的不同鏈長(zhǎng)非均相混合物，一般由3～8 個(gè)半乳糖分子和1 個(gè)葡萄糖殘基組成，具有類(lèi)似于HMOs 益生元的功效[124]。FOS是由果糖以β-2，1 或β-2，6 糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性或分支型果糖聚合物，通常在末端連接一個(gè)葡萄糖殘基，易在菊苣/芋中提取[125]。Knol 等[126]通過(guò)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，喂食含有GOS 和FOS （質(zhì)量比9：1）的配方奶粉會(huì)得到與母乳喂養(yǎng)嬰兒相似的腸道菌群。Roberfroid[127]和Boehm[90]對(duì)FOS 和GOS 的臨床和益生元效果進(jìn)行了綜述。盡管已證明在許多靶點(diǎn)有效，如減少嬰兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)生率[128]，但在結(jié)構(gòu)上與HMOs 和BMOs 有很大不同 （圖3）。FOS 和GOS 是線(xiàn)性鏈，而HMOs 和BMOs 是支鏈結(jié)構(gòu)。前者不存在巖藻糖、唾液酸和N-乙酰葡糖胺等單體，也沒(méi)有表現(xiàn)出固有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。為彌補(bǔ)嬰幼兒配方奶粉與母乳之間的差距，已開(kāi)發(fā)出許多模擬HMOs 方法。例如：化學(xué)催化、酶催化、微生物發(fā)酵、膜分離以及轉(zhuǎn)基因等。如表7所示，全球主要的HMOs 生產(chǎn)廠(chǎng)家約10 家。

表7 全球主要市售HMOs 及其生產(chǎn)廠(chǎng)家Table 7 Global commercially available HMOs and their manufacturers

化學(xué)模擬需要對(duì)每一個(gè)HMOs 分子進(jìn)行重復(fù)保護(hù)和脫保護(hù)步驟。Dékany 等[129]使用化學(xué)方法開(kāi)發(fā)了一種晶體中間體技術(shù)，來(lái)輔助保護(hù)HMOs 的純化步驟，并利用該方法快速模擬了2′-FL。盡管化學(xué)模擬方法得到了發(fā)展，但對(duì)于工業(yè)規(guī)模的HMOs 模擬仍有一些缺陷，如只能模擬短鏈HMOs、立體選擇性和總產(chǎn)率低以及存在有毒試劑殘留風(fēng)險(xiǎn)等。因此，酶法和微生物法得到快速發(fā)展。例如，Choi 等[130]使用幽門(mén)螺桿菌的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以核苷酸糖和GDP-β-L-巖藻糖為供體模擬了2′-FL 或3′-FL 結(jié)構(gòu)。Endo 等[131]使用細(xì)菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中表達(dá)模擬唾液酸化HMOs。Thomas 等[132]利用從母乳中純化的FUT3，模擬了唾液酸化路易斯a、路易斯a 抗原和X 抗原，但僅限于小規(guī)模的制備。由于耦合微生物方法的高復(fù)雜性和低生產(chǎn)率，現(xiàn)又開(kāi)發(fā)了使用重組大腸桿菌系統(tǒng)的單細(xì)胞方法。Ishikawa 等[133]在重組大腸桿菌細(xì)胞中，通過(guò)表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌slr1975 基因編碼的GlcNAc 2-差異構(gòu)酶和NeuAc 合酶基因編碼的NeuAc 合成酶模擬出NeuAc。

依據(jù)低聚糖的分子質(zhì)量大小，可采用膜分離法進(jìn)行提取。Sarney 等[134]利用β-半乳糖苷酶和納濾開(kāi)發(fā)了一種從脫脂母乳中回收HMOs 的方法。運(yùn)用此法可從1 L 脫脂母乳中獲得約6.7 g HMOs，并且酶解技術(shù)顯著提高了膜分離的效率和選擇性。Altmann 等[135]以酶解脫脂牛乳為原料，采用不同的納濾膜，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室、中試和工業(yè)規(guī)模的BMOs 富集。Cohen 等[136]采用超濾和納濾集成技術(shù)富集了天然GMOs，其回收率達(dá)90%。此外，將人FUT2 基因?qū)胄∈?，可表達(dá)2′-FL。Kelder 等[137]將同源系半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胄∈笠踩〉昧祟?lèi)似的結(jié)果，這表明乳腺會(huì)在糖基轉(zhuǎn)移酶存在下產(chǎn)生相應(yīng)的低聚糖[138]。同時(shí)，將2 種不同巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胄∈?，還能夠模擬巖藻糖基化糖綴合物。因此，對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，可以預(yù)期地表達(dá)基因產(chǎn)物、糖基轉(zhuǎn)移酶、低聚糖和重組糖蛋白等物質(zhì)。

2'-FL 和LNnT 是HMOs 中最豐富的2 種寡糖，大約占總HMOs 的35%。于2015年獲得歐盟和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的監(jiān)管許可，其最大添加量及使用范圍如表8所示。Marriage 等[10]和Reverri 等[139]通過(guò)喂養(yǎng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含2'-FL 的嬰兒配方奶粉可以有效維持嬰兒的生長(zhǎng)和耐受性，且2'-FL 的相對(duì)吸收和排泄與母乳喂養(yǎng)方式無(wú)顯著差異。我國(guó)對(duì)2'-FL 能否作為一種新的食品添加劑，仍處于社會(huì)公開(kāi)征求意見(jiàn)階段（表8）。此外，僅添加1 種或2 種HMOs 到嬰幼兒配方奶粉中無(wú)法再現(xiàn)母乳HMOs 的復(fù)雜作用。因此，開(kāi)發(fā)一種HMOs 替代品需要亟待解決。

表8 我國(guó)及其他發(fā)達(dá)國(guó)家關(guān)于HMOs 最大添加量及使用范圍aTable 8 The maximum amount and scope of HMOs in China and and other developed countriesa

7 BMOs 可作為模擬HMOs 的潛在來(lái)源

牛乳清是制作奶酪時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，通常當(dāng)作廢液排掉[140]或通過(guò)噴霧干燥制備乳清粉以低價(jià)出售[141]。與其它畜乳汁相比，具有量大和成本低等特點(diǎn)。因此，利用乳清進(jìn)行大規(guī)模提取BMOs 作為HMOs 替代品具有重大意義。通過(guò)中式膜設(shè)備從乳清中分離BMOs 的工藝已經(jīng)研發(fā)出來(lái)[136，142]。BMOs 的功能研究也逐漸從體外轉(zhuǎn)向體內(nèi)和臨床試驗(yàn)[143]（圖6）。Daniel 等[144]研究發(fā)現(xiàn)，乳清中的許多BMOs 組成與HMOs 相同。在測(cè)定的15 種酸性BMOs 中，3 種也存在于HMOs 中，8 種中性BMOs中，4 種也存在于HMOs 中。此外，HMOs 中的成分不一定每個(gè)都有效，組合起來(lái)效果似乎更好。Locascio 等[81]利用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法對(duì)雙歧桿菌消耗HMOs 進(jìn)行了糖組學(xué)分析，研究表明嬰兒腸道分離的嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC 15697 （Bifidobacterium longum biovar infantis ATCC 15697）消耗了總HMOs 的63.9%，主要包括5 個(gè)最豐富的短鏈HMOs 和3 個(gè)長(zhǎng)鏈HMOs。

圖6 BMOs 研究進(jìn)程Fig.6 Research progress of BMOs

團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，乳清滲透液中游離BMOs總濃度比原料乳高10 倍[67，145]，此結(jié)果與目前文獻(xiàn)中所述的牛乳只含有微量低聚糖相比，該濃度要高得多。脫除乳糖后，BMOs 濃度可再提高4 倍。因此，膜分離技術(shù)為工業(yè)化生產(chǎn)HMOs 替代品提供了新的解決方案。

8 結(jié)論

HMOs 含量在母乳中僅次于乳糖及脂質(zhì)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，母乳的保護(hù)作用可能部分歸因于HMOs，如益生元、病原體抑制、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和大腦發(fā)育等。HMOs 在分子結(jié)構(gòu)方面也不同于經(jīng)典的GOS 和FOS。為彌補(bǔ)嬰幼兒配方奶粉與母乳之間的差距，部分發(fā)達(dá)國(guó)家已將2'-FL 和LNnT 作為嬰幼兒配方奶粉的補(bǔ)充劑。目前，盡管還沒(méi)有商業(yè)化乳源性HMOs 代替物，但許多研究已表明，BMOs 具有HMOs 類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和生物功能，并且在工業(yè)規(guī)模上使用膜分離技術(shù)提取可行的。因此，商業(yè)開(kāi)發(fā)化BMOs 模擬GOS、FOS 和HMOs，并應(yīng)用于嬰幼兒配方和特殊醫(yī)學(xué)等功能性食品上，既有食品健康的需求，也符合牛乳高附加值加工趨勢(shì)。然而全方位的HMOs 模擬仍不能被商業(yè)化，因此母乳仍然是嬰兒喂養(yǎng)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。