廖俊昭， 王遠(yuǎn)興， 陳熠敏

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047)

人參(Panax Ginseng)為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根，是第三紀(jì)孑遺植物，也是珍貴的中藥材，在我國藥用歷史悠久[1]。而人參多糖是人參發(fā)揮其藥理活性的主要成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，人參多糖具有抗腫瘤[3,4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、降血糖[6]、造血調(diào)控[7]等功能。

糖譜是指多糖通過化學(xué)或酶降解的方式獲得多糖降解產(chǎn)物片段，利用一定的色譜及其聯(lián)用手段分離鑒定，形成能夠表征一類多糖降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征的圖譜，一種多糖只有一個特征糖譜，因此，糖譜可認(rèn)為是具有一定識別功能的指紋圖譜。質(zhì)譜作為一種通用型檢測器，使用范圍廣，檢測靈敏度高，對于復(fù)雜樣品中的未知成分可以提供精確的分子質(zhì)量[8]。高效液相色譜-電噴霧電離高分辨飛行時間質(zhì)譜(HPLC-ESI-QTOF-MS)，使用離子束壓縮技術(shù)和增強型離子反射鏡技術(shù)，具有極高的質(zhì)量精確度和分辨率；進(jìn)行MS/MS分析時，可對選定的母離子施加多個裂解電壓，其與色譜技術(shù)在線聯(lián)用，可為分析物結(jié)構(gòu)解析提供詳盡的信息，已越來越多地應(yīng)用于糖類物質(zhì)的研究中。

本研究通過HPLC-ESI-QTOF-MS研究人參多糖部分酸水解產(chǎn)物，是研究人參糖譜及其他中草藥糖譜的一種新的嘗試；同時研究了不同糖苷鍵在MS/MS分析時的斷裂規(guī)律，并確定了人參多糖中的糖苷鍵鏈接類型，擴(kuò)展和豐富了質(zhì)譜技術(shù)在糖類研究中的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290超高效液相-380蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用儀,Agilent1290超高效液相-6538高分辨率飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)。

乙腈(色譜純級，德國Merk公司)；甲酸(色譜純，美國ROE公司)；海藻糖、曲二糖、β-1,3-葡二糖、纖維二糖、蜜二糖(分析純，美國Aladdin公司)。實驗用水為Milli-Q超純水。

人參(五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根)，購自江西樟樹藥材市場，產(chǎn)地為東北長白山。

1.2 人參多糖的制備[9]

人參充分烘干，粉碎機粉碎。干粉用無水乙醇浸泡12 h，除去大部分醇溶物質(zhì)后，加20倍體積水，于95 ℃提取三次，每次3 h。5 000 r/min離心15 min，合并上清液，減壓旋蒸濃縮至適當(dāng)體積后，濃縮液經(jīng)5 000 r/min離心15 min后取上清，得含人參多糖濃縮液。濃縮液加乙醇至80%，于4 ℃下醇沉12 h，5 000 r/min離心15 min，取沉淀依次經(jīng)乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌，真空冷凍干燥后即得人參多糖。

1.3 人參多糖的部分酸水解

取25 mg人參多糖于安培管，加入0.4 mol/L H2SO45 mL，抽真空封管，于90 ℃下水解60 min后取出水解液，用過量BaCO3中和至中性，離心，取上清液定容至5 mL。上清液過0.22 μm濾膜，備用。

1.4 實驗條件

1.4.1HPLC條件色譜柱：Grace Prevail ES糖分析柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；梯度程序：0～10 min，80%A；10～38 min，80～42%A；38～40 min，42%～80%A；40～45 min，80%A。進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min。

1.4.2ESI-QTOF-MS及MS/MS條件離子模式：負(fù)離子模式；電離模式：電噴霧電離(ESI)。電離電壓3 500 V，干燥器溫度350 ℃，干燥器流速10 L/min，碰撞電壓120 V，Skimmer電壓65 V，質(zhì)量范圍(m/z)：50～3200，采集頻率1.02 s-1。MS/MS裂解電壓：1～15 V。

1.5 五種標(biāo)準(zhǔn)二糖的HPLC-ESI-QTOF-MS及MS/MS分析

將五種標(biāo)準(zhǔn)單糖(葡萄糖)和二糖(海藻糖、曲二糖、β-1,3葡二糖、纖維二糖、蜜二糖)配成一定濃度的水溶液，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC-ESI-QTOF-MS和MS/MS分析。

1.6 人參多糖部分酸水解產(chǎn)物的HPLC-ESI-QTOF-MS及MS/MS分析

人參多糖按1.3步驟處理后，經(jīng)HPLC-ESI-QTOF-MS分析，并對水解液中低聚合度寡糖進(jìn)行MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 五種標(biāo)準(zhǔn)二糖的HPLC-ESI-QTOF-MS及MS/MS分析

選擇五種結(jié)構(gòu)確定的二糖：海藻糖、曲二糖、β1,3-葡二糖、纖維二糖、蜜二糖，分別代表了五種糖苷鍵類型，其結(jié)構(gòu)信息如圖1所示：

圖1 五種二糖的結(jié)構(gòu)式及糖苷鍵類型

圖2 二糖的一級質(zhì)譜圖

實驗使用的五種標(biāo)準(zhǔn)二糖均為兩個六碳糖脫水縮合而成，其中海藻糖、曲二糖、β1,3-葡二糖、纖維二糖的單糖組成均為兩個葡萄糖，而蜜二糖的單糖組成為一個半乳糖和一個葡萄糖；五種二糖的相對分子量均為342.1162，故它們在MS分析時沒有差異。圖2所示為二糖的電噴霧電離高分辨飛行時間質(zhì)譜的負(fù)離子模式分析結(jié)果。其中，m/z341.1138[M-H]-、m/z377.0840[M+Cl]-、m/z387.1138[M+COOH]-、m/z683.2234[2M-H]-為負(fù)離子模式下糖類常見的加合方式，而m/z455.1003的加合質(zhì)量約為112.98，其加合的物質(zhì)不明確，但因為基于本方法分析的所有的單糖和低聚糖時均出現(xiàn)了該質(zhì)量加成，故在圖2上依舊標(biāo)明該質(zhì)荷比。

MS/MS分析時，對目標(biāo)物施加額外的裂解電壓，可將目標(biāo)物打碎并呈現(xiàn)一定的斷裂規(guī)律。對于不同糖苷鍵鏈接的低聚糖乃至多糖，具有不同的斷裂規(guī)律，及質(zhì)量丟失不同。實驗選擇的五種二糖，其糖苷鍵鏈接位點分別不同(圖2)，故在MS/MS分析中反映出不同的裂解規(guī)律。圖3為五種二糖的MS/MS圖。

圖3 二糖的二級質(zhì)譜圖及斷裂位置

如圖3：1,1-糖苷鍵的二糖(海藻糖)在MS/MS中只出現(xiàn)m/z161、179的碎片質(zhì)譜峰，分別為母離子341丟失180和162形成的碎片，其中162為一個糖殘基(C6H10O5)丟失，180(C6H12O6)為丟失162后再丟失一分子H2O。其他糖苷鍵類型二糖的MS/MS中除m/z162、180的質(zhì)量丟失外，還有其他分子量更小的質(zhì)量丟失，丟失規(guī)律表現(xiàn)有：所有糖苷鍵類型都存在120.04(C4H8O)的質(zhì)量丟失；除1,6-糖苷鍵(蜜二糖)外，其余三種糖苷鍵類型都存在60(C2H4O2)；1,2-糖苷鍵(曲二糖)和1,4-糖苷鍵(纖維二糖)不存在90(C3H6O3)的質(zhì)量丟失，且1,2-糖苷鍵同時不存在60的質(zhì)量丟失；1,3-糖苷鍵(β-1,3-葡二糖)和1,6-糖苷鍵(蜜二糖)存在90(C3H6O3)的質(zhì)量丟失，且1,3-糖苷鍵存在78(C2H603)的質(zhì)量丟失，該質(zhì)量丟失為母離子丟失60后再丟失一分子H2O。

綜合五種二糖在負(fù)離子模式下的電噴霧電離高分辨飛行時間質(zhì)譜的MS/MS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)不同的糖苷鍵鏈接位點的不同可導(dǎo)致質(zhì)量丟失不同(表1)；(2)除直接從結(jié)構(gòu)上斷裂導(dǎo)致的質(zhì)量丟失(30、60、90、120、162)，還存在脫水導(dǎo)致的質(zhì)量丟失(18、78、180)；(3)糖殘基能完整斷裂，糖殘基斷裂的位置一定是非1C位的糖苷鍵位點(圖3結(jié)構(gòu)式中糖殘基完整斷裂時的位點選擇)。表1歸納了五種糖苷鍵類型在MS/MS中的斷裂規(guī)律。

表1 不同糖苷鍵鏈接類型的雙糖其在電噴霧電離高分辨飛行時間二級質(zhì)譜中的斷裂規(guī)律

2.2 人參多糖部分酸水解產(chǎn)物的HPLC-ESI-QTOF-MS分析

圖4 人參多糖部分酸水解樣在負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖

按照1.4的色譜和質(zhì)譜條件，對人參多糖的部分酸水解產(chǎn)物(主為單糖和低聚糖)進(jìn)行質(zhì)譜分析，其總離子流色譜圖(TIC)見圖4，從中可觀察到從單糖到聚合度14的人參低聚糖。結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，單糖在15～20 min出現(xiàn)，低聚糖在22～40 min按聚合度由低到高依次出現(xiàn)，且在質(zhì)譜圖中可觀察到DP34的聚糖。

人參粗多糖部分酸水解產(chǎn)物在負(fù)離子模式下的MS信息見表2。人參多糖部分酸水解產(chǎn)物中，單糖離子峰的m/z179.0555為己糖，未發(fā)現(xiàn)含戊糖、脫氧戊糖、脫氧己糖、糖醛酸等其他單糖類型的離子峰。人參低聚糖的單電荷離子峰以大約162 Da遞增，雙電荷離子峰以大約81 Da遞增，三電荷離子峰以大約54 Da遞增，符合己糖規(guī)律。表明本研究提取的人參粗多糖為己糖及其殘基組成的多糖。

表2 人參多糖部分酸水解樣中單糖和低聚糖在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

(續(xù)表2)

2.3 人參多糖部分酸水解物的HPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析

對人參多糖部分酸水解產(chǎn)物中聚合度為2、3、4的低聚糖進(jìn)行MS/MS分析，參照2.1中不同糖苷鍵的低聚糖在MS/MS分析時的斷裂規(guī)律，判斷人參低聚糖乃至人參多糖的糖苷鍵類型。

圖5為人參二糖的MS/MS圖，在人參二糖二級質(zhì)譜峰內(nèi)，發(fā)現(xiàn)兩種了斷裂規(guī)律(質(zhì)量丟失不同)。人參二糖1的MS/MS圖中出現(xiàn)了m/z323、281、263、221、179和161的碎片離子質(zhì)譜峰，質(zhì)量丟失分別為18、60、78、120、162和180，其斷裂規(guī)律符合1，4糖苷鍵；人參二糖的MS/MS圖中出現(xiàn)m/z323、281、263、251、221、179和161的碎片離子質(zhì)譜峰，質(zhì)量丟失分別為18、60、78、90、120、162和180，其斷裂規(guī)律符合1，3糖苷鍵。故人參二糖的MS/MS分析結(jié)果顯示：人參二糖中含以1,3糖苷鍵鏈接的和以1,4糖苷鍵鏈接的兩種二糖。

圖5 人參二糖的二級質(zhì)譜圖

人參三糖和人參四糖的MS/MS分析結(jié)果與人參二糖類似(圖略)，同時出現(xiàn)符合1,4糖苷鍵和1,3糖苷鍵裂解規(guī)律的碎片離子。人參低聚糖的MS/MS結(jié)果表明人參粗多糖中含有1,3糖苷鍵和1,4糖苷鍵，與采用傳統(tǒng)方法研究人參多糖結(jié)構(gòu)的相關(guān)文獻(xiàn)報道[10,11]一致。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜研究人參指紋性糖譜的方法，研究不同糖苷鍵在二級質(zhì)譜分析時的斷裂規(guī)律，建立基于飛行時間質(zhì)譜分析確定糖類物質(zhì)中糖苷鍵鏈接位點的方法。發(fā)現(xiàn)了不同糖苷鍵在二級質(zhì)譜分析時的斷裂規(guī)律，建立依靠質(zhì)譜分析快速確定糖類糖苷鍵類型的方法。結(jié)果表明人參多糖是由己糖及其殘基通過1,3糖苷鍵和1,4糖苷鍵鏈接構(gòu)成。

研究的不足之處在于：糖類物質(zhì)由于單位結(jié)構(gòu)和組成的特殊性，其同分異構(gòu)現(xiàn)象十分普遍，僅僅依靠質(zhì)譜檢測很難對糖類物質(zhì)的進(jìn)行定性分析，只能確定糖類物質(zhì)的化學(xué)式(如低聚糖的聚合度)，無法確定其具體結(jié)構(gòu)；限于酸水解方法的局限性，無法確定糖苷鍵在多糖鏈的具體位置。之后的研究將對人參多糖基于特異性1,3糖苷鍵和1,4糖苷鍵水解酶作用下酶解產(chǎn)物的MS及MS/MS分析。