陳 瀅,王 杰,趙 倩,倪倩倩,侯 超

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.護理學(xué)院、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3.第一附屬醫(yī)院新生兒科，安徽 合肥 230032； 4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，安徽 合肥 230032)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性和女性最常被診斷出的癌癥中分別位列第3位和第2位，也是全世界癌癥死亡的第2大主要原因[1]。隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，結(jié)直腸癌的治療方法日趨多元化，外科切除配合放射、藥物療法、靶向治療等不同綜合治療方法不斷出現(xiàn)，但是患者預(yù)后仍未見顯著變化，并且隨著腫瘤耐藥機制的產(chǎn)生，藥物治療效果變差，新的治療方法亟待產(chǎn)生[2-3]。中腦新型膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)誘導(dǎo)的分泌性蛋白[4]，在多種ER應(yīng)激相關(guān)疾病中具有保護作用[5-8]。MANF在炎癥刺激下入核，與p65的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制NF-κB通路，發(fā)揮抗炎作用[9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，SUMO1可以促進MANF的核轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB通路，發(fā)揮抑制肝癌的作用[10]。有研究表明NF-κB通路的激活也是結(jié)直腸癌的重要發(fā)病機制之一[11]，但目前尚無MANF在胃腸道腫瘤中相關(guān)作用的報道。故該實驗擬通過在結(jié)直腸癌細胞系Caco-2中過表達MANF來研究其對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，并探索可能的作用機制，為結(jié)直腸癌的治療提供新型藥物作用方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及質(zhì)粒 細胞系Caco-2細胞購自武漢Procell公司；pEGFP-C2-MANF質(zhì)粒與pEGFP-C2質(zhì)粒為安徽醫(yī)科大學(xué)沈玉先課題組惠贈；

1.1.2試劑 轉(zhuǎn)染試劑jetprim buffer購自法國保利嘉公司；DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone,批號 AE29431646)；TRIzol(美國Ambion,批號 190903)SYBR Green(日本TOYOBO,批號 9283373)；MANF、caspase-3/cleaved caspase-3抗體(英國Abcam)；β-actin antibody、羊抗兔IgG-HRP(沈陽萬類生物)；ECL發(fā)光液(康為世紀， 批號 03782/60319)、CCK8試劑盒(南京Vazyme，批號 806051)；Matrigel膠(美國Corning，批號 0042321)；PE Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit (美國BD，批號 9283373)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega)；重組人TNF-α(中國義翹神州)；上下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州蘇潔醫(yī)療器械有限公司)；電泳儀(美國BIO-RAD)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)；流式細胞儀(美國BD)

1.2 方法

1.2.1MANF過表達Caco-2細胞系的建立與驗證 參照jetPRIME試劑說明書分別轉(zhuǎn)染GFP空載體和MANF-GFP質(zhì)粒進入Caco-2細胞，1 d后通過熒光判斷轉(zhuǎn)染效率。分別提取MANF-GFP組和GFP組細胞總RNA，測定濃度后，進行逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA。取上述cDNA作為模板，上下游引物(MANF上游引物：5′-CGACTGCGAAGTTTGTATTT-3′，MANF下游引物：5′-GTGGCTGCATCATCTGTG-3′；β-actin上游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，β-actin下游引物：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′)、SYBR Green mastermix、H2O，按照說明書指示進行熒光定量，利用2-△△CT方法對結(jié)果進行分析。

1.2.2細胞遷移侵襲試驗 將Caco-2細胞分為NC組、GFP組和MANF-GFP組，NC組不進行轉(zhuǎn)染處理，GFP組和MANF-GFP組分別轉(zhuǎn)染GFP空載體質(zhì)粒和MANF-GFP質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染好的各組Caco-2細胞制成1×106個·mL-1濃度的細胞懸液。用稀釋好的基質(zhì)膠涂布到上室膜上，預(yù)先包被。遷移實驗：下室內(nèi)加入500 μL培養(yǎng)基，放入未包被的小室，加入100 μL細胞懸液；侵襲實驗：下室內(nèi)加入500 μL培養(yǎng)基，放入包被的上室，加入100 μL細胞懸液。培養(yǎng)48 h后，分別計數(shù)底室Caco-2細胞數(shù)目。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 將Caco-2細胞分為NC組、GFP組、MANF-GFP組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，測定OD值。

1.2.4免疫印跡實驗 提取細胞總蛋白，沸水浴10 min，分別測定GFP組與MANF-GFP組蛋白濃度。經(jīng)過SDS-PAGE膠分離蛋白，轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜，以BSA溶液封閉1 h，分別用MANF、caspase-3、β-actin抗體于4 ℃冰箱過夜，二抗在25 ℃條件下孵育2 h，顯影進行灰度分析。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 分別收集GFP組和MANF-GFP組Caco-2細胞。以1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心沉淀細胞，PBS清洗，重復(fù)上述操作2遍。加入結(jié)合緩沖液，用移液器緩慢吹打，將Caco-2細胞制成懸液，吸取100 μL懸液到流式管中，分別添加5 μL的PE Annexin Ⅴ、Propidium Iodide和7-AAD，混勻后于暗處室溫孵育15 min。各管補加400 μL binding buffer, 混勻后在儀器上檢測。

1.2.6熒光素酶報告實驗 將細胞分為GFP組、MANF組、GFP+TNF-α組、MANF+ TNF-α組，按分組加入TNF-α(0.01 ng·L-1)刺激8 h。吸去培養(yǎng)液， PBS洗2遍，每組細胞加入200 μl的lysis solution，室溫裂解15 min后，收集裂解液作為樣品。分別測量樣品的Firefly和Renilla值，記錄熒光素酶的比值。

2 結(jié)果

2.1 外源性MANF在Caco-2細胞中成功表達收集MANF-GFP與空載體GFP轉(zhuǎn)染Caco-2細胞，分別提取RNA與總蛋白，用RT-PCR和Western blot方法檢測MANF mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示外源性MANF成功轉(zhuǎn)入Caco-2細胞(Fig 1)。

2.2 MANF具有抑制Caco-2細胞遷移、侵襲的能力Transwell Caco-2細胞遷移實驗結(jié)果如Fig 2A所示，與NC組比較，GFP組Caco-2細胞遷移能力沒有減弱；與GFP組比較，MANF-GFP組Caco-2細胞遷移能力明顯減弱(P<0.01)；Transwell Caco-2細胞侵襲實驗結(jié)果如Fig 2B所示，與NC組比較，GFP組Caco-2細胞侵襲能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與GFP組比較，MANF-GFP組Caco-2細胞侵襲能力減弱(P<0.01)。結(jié)果表明在Caco-2細胞中過量表達MANF可有效下調(diào)細胞的遷移和侵襲能力。

Fig 2 Influence of MANF on Caco-2 cell migration

2.3 MANF具有抑制Caco-2細胞增殖的能力CCK-8細胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，MANF-GFP組(OD值=0.275±0.035)顯著低于GFP組(OD值=0.371±0.047)(P<0.01，F(xiàn)ig 3 )。結(jié)果表明細胞中過量表達MANF可以抑制Caco-2細胞的增殖。

2.4 MANF促進Caco-2細胞凋亡WB結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MANF-GFP質(zhì)?？梢蕴岣逤aco-2細胞中cleaved caspase-3蛋白的生成；flow cytometry實驗顯示，GFP組發(fā)生凋亡的Caco-2細胞比例(0.0273)，低于MANF-GFP組發(fā)生凋亡的Caco-2細胞比例(0.1884)(Fig 4 )。結(jié)果表明過表達MANF可以促進Caco-2細胞凋亡。

Fig 3 Influence of MANF on Caco-2 cell sensitivity detected

Fig 4 Influence of MANF on Caco-2 cell apoptosis

2.5 過表達MANF降低NF-κB轉(zhuǎn)錄活性NF-κB熒光素酶報告實驗顯示，空載體GFP組相對值(1.00±0.14)高于MANF組相對值(0.51±0.07)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TNF-α刺激后，空載體GFP組相對值(1.66±0.17)，仍高于MANF組相對值(1.18±0.13)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)ig 5)。結(jié)果表明MANF可以有效抑制NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)錄激活。

Fig 5 Influence of MANF on Caco-2 cell NF-κB

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率不斷上升[12]。對于Ⅲ期結(jié)直腸癌患者普遍推薦手術(shù)后氟尿嘧啶、奧沙利鉑聯(lián)合化療，降低癌癥復(fù)發(fā)率，提高患者生存率[13]。但是幾乎所有結(jié)直腸癌患者都會出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致抗癌藥物療效下降，尋找新的更為有效的結(jié)直腸癌輔助治療方法尤為重要[2]。

MANF是一個高度保守的可溶性蛋白，分子量約為18ku，ER應(yīng)激可誘導(dǎo)其分泌[4]，MANF在多種ER應(yīng)激相關(guān)疾病中具有保護作用[5-8]。目前關(guān)于MANF的研究大多集中在對缺血、缺氧的神經(jīng)元細胞及心肌細胞的保護作用，在小鼠的心肌梗死模型中，給予外源重組MANF能減少組織損傷[5]；在慢性房顫患者中，MANF的下調(diào)可導(dǎo)致更多的心房細胞凋亡[14]；MANF可通過抑制ER應(yīng)激和激活PI3K/Akt/mTOR通路對黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)發(fā)揮長期的神經(jīng)保護和神經(jīng)再生功能[7]；MANF可通過抑制自噬，明顯改善6-羥多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用[8]；MANF可改善腦缺血大鼠的行為，減少神經(jīng)元的死亡，并減少大鼠腦梗塞面積[15]。近年來，有研究關(guān)注到MANF與腫瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與鄰近的非癌組織相比，肝細胞癌(HCC)組織中的MANF mRNA和蛋白水平較低。MANF表達水平高的患者比低水平的患者具有更好的生存率。體外實驗表明MANF抑制了肝癌細胞的遷移和侵襲，肝細胞特異性缺失MANF會加速N-亞硝基二乙胺(DEN)誘導(dǎo)的HCC，提示MANF可能是抑癌因子[10]。本實驗在Caco-2細胞中過表達MANF，通過CCK8試驗、Transwell試驗、免疫印跡試驗、流式細胞試驗，發(fā)現(xiàn)MANF可以抑制Caco-2細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，并促進細胞凋亡，提示MANF具有抑制Caco2細胞生物學(xué)功能的影響。

NF-κB蛋白家族，又名Rel蛋白家族，是由一系列名為NF-κB1(p50)，NF-κB2(p52)，RelA(p65)，RelB和c-Rel的蛋白分子組成?；镜腘F-κB信號通路過程為IκB蛋白通過遮蓋RelA、RelB和c-Rel的核轉(zhuǎn)移序列來阻止其入核與DNA結(jié)合。IκB激酶復(fù)合物IKK可被胞外刺激信號(如：TNF-α、LPS等)激活，使IκB磷酸化，繼而通過泛素蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致NF-κB的核定位序列暴露，NF-κB直接入核并結(jié)合DNA，調(diào)控多種細胞因子和抗凋亡基因[16]。NF-κB通路可以促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞的凋亡，是結(jié)直腸癌的重要發(fā)病機制之一[11]。研究表明，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，細胞中抗凋亡、促增殖以及免疫相關(guān)的基因就會表達上調(diào)[17]。結(jié)腸癌組織大量浸潤T細胞產(chǎn)生大量Th17相關(guān)細胞因子，TNF-α和IL-6，激活NF-κB促進結(jié)腸癌細胞增殖[18]。MANF具有抑制NF-κB通路的作用[9-10]。在兔關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn)MANF在炎性增厚的滑膜組織表達增多，并且MANF能在炎癥的誘導(dǎo)下由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)運，在神經(jīng)細胞中也觀察到同樣現(xiàn)象。MANF入核后與p65的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制NF-κB通路，發(fā)揮抗炎作用[9]。深入研究MANF的入核機制發(fā)現(xiàn)：SUMO1可以促進MANF的核轉(zhuǎn)位，增強MANF與p65的相互作用[10]。本研究用熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明，在Caco-2細胞中，與對照組相比，MANF可以顯著抑制NF-κB信號通路，提示MANF可能是通過調(diào)控NF-κB通路，從而發(fā)揮其抑癌基因的作用。但MANF在結(jié)直腸癌中具體通過何種機制調(diào)控NF-κB，有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MANF可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，并促進其細胞凋亡，可能通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，有望成為治療結(jié)直腸癌的新靶點。