于曉霞 王洪梅 朱虹 吳華 鄭明楠 樸明姬 邊艷 高弼虎

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 116001

細(xì)胞死亡是一種多途徑多模式過程。目前認(rèn)為，除細(xì)胞壞死外，凋亡、自噬、焦亡和脹亡等是細(xì)胞死亡的主要方式。近年來，鐵死亡作為一種新型程序性細(xì)胞死亡方式逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多種重大慢性疾病如腎癌、胰腺癌、帕金森綜合征以及心肌病等發(fā)生發(fā)展過程中均有鐵死亡現(xiàn)象［1］。Nie 等［2］觀察到，利用索拉菲尼誘導(dǎo)鐵死亡對肝細(xì)胞癌具有抑制作用，Ratan［3］通過干預(yù)鐵死亡可以改善神經(jīng)元損傷，這些結(jié)果均提示通過調(diào)控鐵死亡對疾病可能有潛在治療作用。而在腎臟病領(lǐng)域，也觀察到鐵死亡參與急性腎損傷［4］，但在局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomurular sclerosis，F(xiàn)SGS）中尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬通過注射阿霉素（ADR）建立FSGS 小鼠模型，并采用電子顯微鏡、生化試劑盒和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等方法檢測FSGS 中是否存在鐵死亡，為進(jìn)一步揭示FSGS 發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康SPF 級雄性BALB/c 小鼠40 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（21.00±2.35）g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（遼）2018-0005。小鼠完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為對照組（20 只）、模型組（20 只）。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物在飼養(yǎng)籠中常規(guī)飼養(yǎng)，可自由攝食和飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的要求，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（編號為2021003），依照動(dòng)物福利與倫理原則處理。

1.2 藥物及試劑 ADR 注射粉劑購自北京索萊寶科技有限公司，批號：D8740。異氟烷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：B2028066。戊巴比妥那購自美國Sigma公司，批 號：P3761。尿白蛋白/肌 酐（albumin to creatinine，ACR）檢測試劑盒購自南京建成有限公司，批號：20200722。TRNzol 總RNA 提取試劑購自天根生化科技公司，批號：DP405。PCR 引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。qRT-PCR 試劑盒購自Bimake 公司，批號：B21202。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0053。丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0131M。

1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡：日本Olympus 公司CX41；低溫離心機(jī)：德國Sigma 公司8K；脫水機(jī)：武漢俊杰電子有限公司JJ-12J；包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司JB-P5；病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司RM2016。PCR 儀：德國Eppendorf 公司5331；H-600 透射電鏡：日本HIYACH 公司。酶標(biāo)儀：美國Thermo 公司。7500 Real Time PCR 儀：美國Applied Biosystems公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及給藥 模型組：一次性經(jīng)眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立實(shí)驗(yàn)FSGS 小鼠模型。對照組：眼球后注射與ADR同等劑量的生理鹽水。

1.4.2 ACR 檢測 分別于小鼠造模前1 d（0 周）及實(shí)驗(yàn)第1 周、第8 周末收集尿液，低速低溫離心機(jī)中離心（4 000 r/min，4 min，4 ℃，離心半徑為14 cm）去除沉渣，按試劑盒檢測說明采用ELISA 法測定小鼠尿白蛋白和肌酐，計(jì)算ACR。

1.4.3 腎臟取材及病理學(xué)檢查 第8 周末，小鼠麻醉后處死，分別取各組小鼠左側(cè)2/3 腎臟，PBS 沖洗后去除包膜，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，75%～100%乙醇逐步脫水，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度2 μm），行過碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS），光鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。各組小鼠剩余左側(cè)1/3 腎臟，PBS 沖洗后去除包膜，切成約1 mm2小塊，2.5%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，透射電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

1.4.4 腎組織GSH 和MDA 檢測 取小鼠新鮮右側(cè)腎臟組織，稱重后按1∶9的比例加入冷生理鹽水后進(jìn)行均漿5 min，制成10% 均漿液，低溫離心機(jī)，3 000 r/min 離心10 min，4 ℃，離心半徑為14 cm），取上清液按試劑盒要求用酶標(biāo)儀測量GSH和MDA濃度。

1.4.5 應(yīng)用qRT-PCR 測量小鼠腎組織PTGS2 mRNA水平 應(yīng)用Trizol 提取腎組織總RNA，檢測RNA的濃度及純度。按照RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量RT-PCR 試劑盒說明書操作，檢測腎組織PTGS2 mRNA 表達(dá)，以GAPDH 作為內(nèi)參。所用PCR引物如下，PTGS2：正向引物為5’-TGGAGGCGAAGTGGGTTTTA-3’，反向引物為5’-GAGTGGGAGGCACTTGCATT-3’；GAPDH：正向引物為5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3’，反向引物為5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ACR 變化 兩組小鼠造模前ACR 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），造模后第1 周及第8 周，模型組小鼠ACR水平均顯著高于對照組（均P＜0.001），見表1。

表1 兩組小鼠造模前、造模后第1周與第8周ACR比較（mg/mg)

表1 兩組小鼠造模前、造模后第1周與第8周ACR比較（mg/mg)

注：模型組一次性經(jīng)眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立實(shí)驗(yàn)FSGS 小鼠模型，對照組眼球后注射與ADR 同等劑量的生理鹽水；ACR 為尿白蛋白/肌酐，ADR 為阿霉素，F(xiàn)SGS 為局灶節(jié)段性腎小球硬化

2.2 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 對照組小鼠腎小球及間質(zhì)小管均未見明顯異常（見圖1A、B）。模型組小鼠第8周末可見彌漫腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多，腎小球局灶、節(jié)段性硬化（黑色箭頭），腎間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落，管腔中大量蛋白管型（見圖1C、D）。

圖1 兩組小鼠腎組織PAS染色比較（A為對照組×100；B為對照組×400；C為模型組×100；D為模型組×400）

2.3 足細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 對照組小鼠足細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)未見明顯異常（見圖2A），而模型組小鼠足細(xì)胞可見線粒體萎縮（黑色箭頭），線粒體嵴減少和線粒體膜破裂（紅色箭頭）等典型鐵死亡的線粒體形態(tài)學(xué)改變（見圖2B）。

圖2 兩組小鼠足細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變（A為對照組，B為模型組）

2.4 腎組織GSH 和MDA 濃度變化 與對照組比較，模型組小鼠腎組織GSH 濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；而模型組小鼠腎組織MDA 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

表2 兩組小鼠腎組織GSH和MDA濃度比較（mmol/L）

表2 兩組小鼠腎組織GSH和MDA濃度比較（mmol/L）

注：模型組一次性經(jīng)眼球后注射ADR（13 mg/kg）建立實(shí)驗(yàn)FSGS 小鼠模型，對照組眼球后注射與ADR 同等劑量的生理鹽水；MDA 為丙二醛，GSH 為谷胱甘肽，ADR 為阿霉素，F(xiàn)SGS 為局灶節(jié)段性腎小球硬化

2.5 腎組織PTGS2 mRNA 表達(dá)水平 對照組小鼠腎組織中鐵死亡標(biāo)志物PTGS2 mRNA 水平為（1.34±1.61），模型組為（5.94±3.51），模型組PTGS2 mRNA 表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.327，P＜0.001）。

3 討 論

鐵死亡是2012 年由Dixon 等［5］命名的一種新型細(xì)胞死亡方式，其主要特征是鐵依賴性的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物和活性氧簇蓄積［6］。目前研究證實(shí)，在腎細(xì)胞癌、乳腺癌、阿爾茨海默病以及心肌病等疾病中均發(fā)現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象［7-10］。但在FSGS 中尚未見相關(guān)報(bào)道，因此本研究主要觀察FSGS模型中是否有鐵死亡發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)首先通過眼球后注射ADR 建立FSGS 小鼠模型，這也是目前實(shí)驗(yàn)研究較常用的FSGS造模方式。ADR是環(huán)蒽類抗生素，可同時(shí)抑制細(xì)胞DNA 及RNA 合成，對腎小球臟層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞均有明顯毒性損傷，最終導(dǎo)致FSGS［11］。本實(shí)驗(yàn)給予ADR注射后，小鼠表現(xiàn)為大量蛋白尿，腎組織PAS 染色呈現(xiàn)典型的FSGS病理形態(tài)學(xué)改變，提示造模成功。

建立FSGS 小鼠模型后，我們進(jìn)一步探索FSGS 中是否有鐵死亡。既往文獻(xiàn)報(bào)道，鐵死亡不具有細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集和凋亡小體形成等傳統(tǒng)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，但用電子顯微鏡可以觀察到線粒體皺縮和雙層膜密度增加等特征性改變［12］。我們的研究也觀察到，F(xiàn)SGS 模型小鼠足細(xì)胞線粒體萎縮，線粒體嵴減少以及線粒體膜破裂等改變，提示FSGS 足細(xì)胞線粒體具有鐵死亡的特征性形態(tài)學(xué)改變。目前研究證實(shí)，GSH 耗竭以及脂質(zhì)過氧化物蓄積均是鐵死亡的特征改變［13］，GSH 減少會(huì)影響谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低細(xì)胞抗氧化能力，致使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加，脂質(zhì)活性氧增多，引起鐵死亡［14］。本文研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS 模型小鼠腎組織中GSH 濃度顯著降低，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 濃度顯著增加，表明FSGS 中可能存在鐵死亡。為驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，我們進(jìn)一步對鐵死亡標(biāo)志基因PTGS2 mRNA［15］的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS 模型小鼠腎組織PTGS2 mRNA 表達(dá)水平顯著增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證實(shí)FSGS中存在鐵死亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FSGS 小鼠模型中存在鐵死亡，讓我們對FSGS 發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識和理解，也為FSGS新藥開發(fā)提供了新視角。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。