張娜， 易茂林

(黃岡市中心醫(yī)院 乳甲外科, 湖北 黃岡 438000)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率正逐年攀升[1]。盡管甲狀腺癌患者的治療方法有所發(fā)展，但甲狀腺癌容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后生存差[2]。甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，深入了解和揭示甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，對于有效的診斷和治療是必不可少的。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，LncRNA) 是長度大于200 nt的RNA分子，其不編碼蛋白質(zhì)，但在腫瘤基因表達(dá)水平的調(diào)控中具有重要的作用，是目前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3-4]。多項(xiàng)研究表明LncRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)活性[5-7]。X染色體失活基因(X inactivate-specific transcript，XISTX染色體失活基因)是LncRNA成員之一，研究報道XIST在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)異常[8-12]，但目前極少報道其在甲狀腺癌中的表達(dá)情況和調(diào)控機(jī)制。microRNAs是一種非編碼RNA，大小約22 nt[13]。據(jù)報道，miR-133a在宮頸癌、胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中均表達(dá)下調(diào)[14-17]。近期，一種新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的觀點(diǎn)被提出，認(rèn)為lncRNAs與miRNAs相互作用，作為競爭的內(nèi)源性RNAs(ceRNAs)發(fā)揮作用，目前尚無研究報道XIST和miR-133a之間是否存在競爭性結(jié)合機(jī)制。本研究通過培養(yǎng)甲狀腺癌細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，探究XIST和miR-133a在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況和對甲狀腺癌增殖、凋亡的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本 收集2015年3月—2017年4月行切除術(shù)的49例甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織樣本，其中男29例、女20例，41～62歲、平均51.8歲。手術(shù)前，所有癌癥患者均未接受化療或放療，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng) 甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthy-ori 3-1和甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO均購自ATCC庫，細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS，Gibco，NY，USA)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在5% CO2，37 ℃的恒溫加濕培養(yǎng)箱中生長。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組 將TPC-1和FTC-133細(xì)胞分為對照組(Control組)、DMSO處理組(DMSO組)、XIST過表達(dá)陰性對照組(oe-NC組)、XIST過表達(dá)組(oe-XIST組)、XIST沉默陰性對照組(si-NC組)、si-XIST組(XIST沉默組)、XIST過表達(dá)陰性對照與miR-133a過表達(dá)陰性對照共轉(zhuǎn)(oe-NC+NC mimic組)、XIST過表達(dá)與miR-133a過表達(dá)陰性對照共轉(zhuǎn)組(oe-XIST+NC mimic組)、XIST過表達(dá)陰性對照與miR-133a過表達(dá)共轉(zhuǎn)組(oe-NC+miR-133a mimic組)及XIST過表達(dá)與miR-133a過表達(dá)共轉(zhuǎn)組(oe-XIST+miR-133a mimic組)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對數(shù)期TPC-1和FTC-133細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，于轉(zhuǎn)染前24 h再懸浮制備細(xì)胞懸液，然后以1×106細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，孵育18～24 h，使每孔細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%。轉(zhuǎn)染前3 h，用不含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖 為探究LncRNA XIST對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響，分別培養(yǎng)TPC-1和FTC-133細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行XIST過表達(dá)和沉默處理，并通過MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。按照Promega試劑盒的說明操作，用含10%FBS的培養(yǎng)基制備5×104細(xì)胞/mL的單細(xì)胞懸浮液。將懸浮液加入96孔板(200 μL/孔)中培養(yǎng)3～5 d。轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48和72 h，然后加入20 μL MTT(5 g/L)。MTT孵育4 h后去除上清液，加入200 μL二甲基亞砜溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的OD值，確定細(xì)胞增殖情況。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。按照PI-Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，NJ，USA)的說明測定細(xì)胞凋亡。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD Bioscience，NJ，USA)檢測細(xì)胞凋亡。采用FACS-Diva軟件BD Bioscience，NJ，USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測LncRNA XIST和miR-133a的表達(dá) 培養(yǎng)甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthy-ori 3-1和甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO，并通過qRT-PCR檢測各細(xì)胞中LncRNA XIST和miR-133a的表達(dá)情況。用TRIzol試劑(NE0260，北京雷根生物技術(shù)有限公司，北京，中國)提取甲狀腺癌細(xì)胞總RNA。利用PrimeScriptⅡ第一鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa，東京，日本)進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄后，通過SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)對獲得的cDNA進(jìn)行qRT-PCR。U6是檢測miR-133a的內(nèi)參，GAPDH是檢測XIST的內(nèi)參。用2 ΔCT法計(jì)算相對表達(dá)。引物由山根生物技術(shù)公司(中國上海)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LncRNA XIST和miR-133a的表達(dá)

LncRNAXIST和miR-133a的表達(dá)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中LncRNAXIST表達(dá)降低，miR-133a表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthy-ori 3-1比較，TPC-1、FTC-133、SW579、WRO細(xì)胞中LncRNAXIST表達(dá)升高，miR-133a表達(dá)降低 ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與癌旁組織比較，P<0.05；(2)與甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori 3-1組比較，P<0.05。圖1 甲狀腺癌組織和細(xì)胞中LncRNA XIST和miR-133a的表達(dá)Fig.1 LncRNA XIST and miR-133a expression in thyroid carcinoma tissues and cells

2.2 XIST對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，在TPC-1和FTC-133細(xì)胞中，0、24、48、72 h 各時點(diǎn)，Control組、DMSO組、oe-NC組和si-NC組細(xì)胞增殖能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。與oe-NC組比較，oe-XIST組TPC-1和FTC-133細(xì)胞在48 h和72 h時增殖能力均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與si-NC組比較，si-XIST組TPC-1和FTC-133細(xì)胞在48 h和72 h時增殖能力均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為TPC-1細(xì)胞0、24、48、72 h時細(xì)胞增殖情況統(tǒng)計(jì)分析，B為FTC-133細(xì)胞0、24、48、72 h時細(xì)胞增殖情況統(tǒng)計(jì)分析；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。圖2 XIST對甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of XIST on the proliferation of thyroid carcinoma TPC-1 and FTC-133 cells

2.3 XIST對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響

在甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細(xì)胞中，Control組、DMSO組、oe-NC組和si-NC組細(xì)胞凋亡比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與oe-NC組比較，oe-XIST組TPC-1和FTC-133細(xì)胞凋亡比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與si-NC組比較，si-XIST組TPC-1和FTC-133細(xì)胞凋亡比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為TPC-1細(xì)胞經(jīng)處理后的細(xì)胞凋亡率，B為FTC-133細(xì)胞經(jīng)處理后的細(xì)胞凋亡率；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。圖3 XIST對甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometry detection on apoptosis of each group

2.4 miR-133a對LncRNA XIST的影響

在甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細(xì)胞中，與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組細(xì)胞中XIST表達(dá)升高，oe-NC+miR-133a mimic組細(xì)胞中miR-133a表達(dá)升高，oe-XIST+miR-133a mimic組細(xì)胞中XIST和miR-133a表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組細(xì)胞miR-133a表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為TPC-1細(xì)胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表達(dá)，B為FTC-133細(xì)胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表達(dá)；(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖4 miR-133a對LncRNA XIST的影響Fig.4 Effect of miR-133a on LncRNA XIST

2.5 XIST通過吸附miR-133a，影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖

與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組TPC-1和FTC-133細(xì)胞48 h和72 h時增殖能力增強(qiáng)， oe-NC+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細(xì)胞48 h和72 h時增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細(xì)胞增殖48 h和72 h時能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖5 XIST對甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細(xì)胞在48、72 h時點(diǎn)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of XIST on carcinoma cell proliferation

2.6 XIST通過吸附miR-133a對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響

與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組TPC-1和FTC-133細(xì)胞凋亡比例降低，oe-NC+miR-133a mimic組細(xì)胞凋亡比例升高(P<0.05)；與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細(xì)胞凋亡比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

注：A為TPC-1細(xì)胞，B為FTC-133細(xì)胞；(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖6 XIST通過吸附miR-133a后甲狀腺癌各組細(xì)胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis of each group after XIST absorption of miR-133a

3 討論

甲狀腺癌的臨床治療策略，包括放射性碘治療、甲狀腺切除術(shù)和促甲狀腺激素抑制治療，但其療效并不理想，患者5年生存率并不令人滿意[18]。深入研究甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，可為甲狀腺癌的診斷和治療提供更有效的策略。LncRNA不編碼蛋白質(zhì)，但在染色質(zhì)重塑、結(jié)構(gòu)支架和轉(zhuǎn)錄基因調(diào)控等過程中具有非常重要的作用[19-21]。LncRNA XIST是研究較多的LncRNAs成員之一，XIST在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并被視作腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物之一[22-24]。本研究通過培養(yǎng)甲狀腺上皮細(xì)胞系和甲狀腺癌細(xì)胞系，并檢測各細(xì)胞系中XIST的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，XIST在甲狀腺癌細(xì)胞系的表達(dá)均異常上調(diào)；且過表達(dá)XIST會導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，凋亡比例顯著降低；而下調(diào)XIST的表達(dá)，可顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此結(jié)果與Liu等[25]研究結(jié)果一致，此結(jié)果提示XIST的表達(dá)變化可調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡。

近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)XIST可能通過吸附microRNA，進(jìn)而發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用[26]。Zhu等[27]研究報道XIST可通過競爭性結(jié)合miR-200a，加速宮頸癌的發(fā)展。Zong等[28]研究報道XIST可通過吸附miR-125b-5p，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。Zhang等[29]研究報道XIST通過吸附miR-200c-3p，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)XIST可吸附miR-133a，這與Wei等報道一致[30]。進(jìn)一步對細(xì)胞進(jìn)行XIST和miR-133a共轉(zhuǎn)染處理，并檢測細(xì)胞的增殖和凋亡變化情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-133a抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；且過表達(dá)miR-133a可改善XIST對甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用和細(xì)胞凋亡的抑制作用，此結(jié)果提示XIST通過吸附miR-133a，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖，抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述， XIST過表達(dá)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖，抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。XIST對甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡情況的調(diào)控可通過吸附miR-133a實(shí)現(xiàn)。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測到XIST在甲狀腺癌中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步完善XIST對甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的機(jī)制，為甲狀腺癌的發(fā)展提供了新的思路，并為臨床上治療甲狀腺提供新的理論依據(jù)。但目前本研究尚未進(jìn)行更深入的機(jī)制探究，進(jìn)一步探究miR-133a可能的下游靶標(biāo)，且研究范疇仍局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，下一步本研究將進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證XIST/miR-133a在甲狀腺癌中的調(diào)控機(jī)制。