姚麗娜， 張鵬舉

(保定市第二中心醫(yī)院， 河北 保定 071000)

缺血性腦卒中的主要病因是頸動脈和(或)椎動脈提供血液的動脈狹窄或閉塞，大腦供血不足所致的腦缺血性損傷[1]。腦缺血性損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及能量衰竭、酸中毒、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體損傷、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等 ，最終導(dǎo)致細胞壞死或凋亡[2-4]。對急性腦缺血最有效的治療方法是在適當?shù)臅r間窗口內(nèi)進行溶栓再灌注[5-7]。miRNA參與調(diào)節(jié)各種病理生理過程，這些過程與細胞凋亡、增殖和個體發(fā)育密切相關(guān)[8]，miR-130a的表達在缺血再灌注后增加，并且與患者的治療效果和預(yù)后密切相關(guān)[9]。磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)作為具有磷酸酶活性的癌癥抑制基因，在腦損傷中的作用逐漸受到關(guān)注[10]。PTEN可負性調(diào)控Akt/PKB信號通道，參與由腦缺血再灌注誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)[11]。目前關(guān)于miR-130a對腦缺血和PTEN/PI3K/Akt信號通路影響的研究較少，本研究旨在探究miR-130a通過PTEN/PI3K/Akt信號通路對神經(jīng)元功能是否有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只、體質(zhì)量250～280 g，在溫度(23±2)℃、濕度(45±5)%、無特定病原體的環(huán)境中，規(guī)律晝夜節(jié)律適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2藥物與試劑 10%水合氯醛(上海碧云天公司)，miR-130a模擬物(Genechem公司，上海)，陰性對照載體(Genechem公司，上海)，Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，美國)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，pGL3報道載體(Promega公司，美國)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)，TUNEL試劑盒(上海碧云天公司)，放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液(北京TDY Biotech公司)，小鼠抗大鼠p-Akt單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠p-GSK3β單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠p-c-Raf單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，山羊抗兔二抗(上海碧云天公司)。

1.1.3主要儀器 雙重?zé)晒馑孛笀蟾嫦到y(tǒng)(Promega公司，美國)，Gen5酶標儀(BioTek，美國)。

1.2 方法及觀察指標

1.2.1動物分組 60只大鼠隨機分為對照組(正常飼養(yǎng)，假手術(shù)處理，n=20)、模型組(缺血性腦卒中模型，n=20)和模擬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染組(將miR-130a模擬轉(zhuǎn)染注射到大鼠的側(cè)腦室，n=20)，實驗獲河北省動物倫理學(xué)委員會的批準(審批號2019322)。

1.2.2模型制備 對照組僅切開皮膚不做進一步處理即縫合皮膚。模型組和模擬轉(zhuǎn)染組大鼠，10%水合氯醛以300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，頸正中縱向切口、分離皮下組織，用動脈夾鉗夾頸總動脈、在頸外動脈上做一個小切口、插入縫合線至頸內(nèi)動脈以阻斷大腦中動脈的血液供應(yīng)。放開頸總動脈夾后，將大鼠飼養(yǎng)在單獨的籠子中直至復(fù)蘇，并觀察飲水狀態(tài)和傷口。對照組未插入縫合線，其余操作與模型組同。在放開勁總動脈夾之前，保留縫合線的情況下對頸外動脈的切口進行縫合，并予以青霉素抗感染治療。

1.2.3神經(jīng)學(xué)受損功能評分 于手術(shù)后第1、10和15天時，采用改良的神經(jīng)損傷嚴重程度評分量表(mNSS)評估各組大鼠的神經(jīng)缺陷程度。mNSS標準分數(shù)從0分(正常)～21分(最大缺陷分數(shù))，得分越高提示神經(jīng)功能受損程度越高。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染方法 mNSS測試后處死大鼠，采用PCR檢測miR-130a和PTEN mRNA轉(zhuǎn)錄水平，分離手術(shù)側(cè)腦組織，加入質(zhì)量/體積比為100 g/L的TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-130a和PTEN基因的表達情況，miR-130a上游引物miR-130a-F為5′-ACACTCCAGCTGGGGCTCTTTTCACATTGT-3′,下游引物miR-130a-R為5′- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT CAGTTGAGAGTAGCAC-3′。PTEN上游引物PTEN-F為5′-GTGCAGATAATGACAAG-3′，下游引物PTEN-R為5′-GATTTGACGGCTCCTCT-3′。PCR擴增時64 ℃退火，延伸40 s，循環(huán)30次；并以GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物GAPDH-F為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物GAPDH-R為5′-GTGCAGATAATGACAAG-3′;PCR擴增時62 ℃退火，延伸10 s，循環(huán)30次。結(jié)束后取反應(yīng)液5 μL進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR產(chǎn)物。模型組和模擬轉(zhuǎn)染組大鼠的腦皮質(zhì)細胞實施質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。具有miR-130a模擬物，陰性對照載體獲自Genechem公司(上海)，以適當?shù)拿芏冉臃N后，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，美國)轉(zhuǎn)染細胞。細胞培養(yǎng)至密度為70%左右，采用0.25%胰酶消化細胞，完全培養(yǎng)基1 mL重懸細胞并計數(shù)。將細胞分為對照組、miR-130a抑制物陰性對照組和miR-130a抑制物組，分別接種于6孔板，每組3個復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。miR-130a抑制物陰性對照組和miR-130a抑制物組采用脂質(zhì)體2 000以100 pmol/LmiR-130a抑制物陰性對照或miR-130a抑制物轉(zhuǎn)染細胞，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實時熒光定量PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效率(計算方法：轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒攜帶熒光標記，計算流式細胞儀檢測后的熒光細胞比例)，進行后續(xù)實驗。

1.2.5螢光素酶法測定野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性 將野生和突變的PTEN的3′UTR(PTEN3′UTR-WT或3′UTR-MUT)分別插入pGL3報道載體(Promega公司，美國)的下游，將帶有miR-130a模擬物/抑制劑和PTEN-pGL3報告基因的載體共轉(zhuǎn)染到腦組織中。轉(zhuǎn)染后2 d，使用雙重?zé)晒馑孛笀蟾嫦到y(tǒng)(Promega公司，美國)在Gen5酶標儀(BioTek，美國)上評估野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性。

1.2.6TNF-α、IL-6和IL-10表達的測定 分離手術(shù)側(cè)腦組織，使用ELISA試劑盒測量腦組織中TNF-α、IL-6和IL-10表達。

1.2.7TUNEL染色確定細胞凋亡水平 分離手術(shù)側(cè)腦組織，制成石蠟切片。通過TUNEL染色檢測腦組織的神經(jīng)元凋亡水平：去石蠟，切片用3%過氧化氫處理10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，滴加蛋白酶K溶液，37 ℃孵育10 min；PBS沖洗3次，滴加TdT和DIG-d-UTP溶液，4 ℃孵育2 h；將切片用PBS沖洗3次后，在室溫下用40 μL封閉緩沖液密封30 min，滴加抗體(1 ∶100)，37 ℃的濕箱中孵育30 min；將切片用PBS沖洗3次后，滴加SABC-FITC二抗(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次；共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄缺血半球中TUNEL陽性細胞數(shù)。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白的表達 分離手術(shù)側(cè)腦組織，稱重后加入放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液(北京TDY Biotech公司)，質(zhì)量/體積比為100 g/L以及1%的磷酸酶抑制劑和1%的蛋白酶抑制劑，勻漿、10 000 g和4 ℃下離心10 min，對總蛋白進行定量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，在80 V下添加等體積的蛋白質(zhì)樣品進行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜；用新鮮制備的5%脫脂奶粉將蛋白條帶密封1 h，與p-Akt(1 ∶1 000)、p-GSK3β(1 ∶1 000)、p-c-Raf(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)在4 ℃過夜；用含Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌3次(5 min/次)，與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000，上海碧云天公司)、室溫下放置1 h，TBST洗滌3次(5 min/次)，TBST洗膜5 min×3次，加人顯影液,顯影并拍照掃描后用Image J軟件計算各條帶的灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 mNSS評分

與對照組比較，模型組在第1、10、25時的mNSS評分均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉(zhuǎn)染組大鼠在手術(shù)后第10、25天時mNSS評分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與術(shù)后第1天比較，模擬轉(zhuǎn)染組大鼠在手術(shù)后第10、25天時mNSS評分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示隨著手術(shù)時間的推延，miR-130a模擬物可降低模型組大鼠mNSS評分，miR-130a的表達可降低大鼠神經(jīng)細胞的功能損傷程度。見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分Tab.1 mNSS scores of rats in each group

2.2 miR-130a和PTEN mRNA表達

與對照組比較，模型組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織的miR-130amRNA表達降低，PTENmRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉(zhuǎn)染組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織miR-130amRNA表達升高，PTENmRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 手術(shù)側(cè)腦組織miR-130a和PTEN mRNA表達Tab.2 Expression of miR-130a and PTEN mRNA in cerebral tissue of surgery side

2.3 野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性

與對照組比較，模擬轉(zhuǎn)染組腦組織的野生型-PTEN表達降低，突變型-PTEN表達也降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組大鼠野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性Tab.3 Luciferase activity of wild-type-PTEN and mutant -PTEN

2.4 TNF-α、IL-6和IL-10表達

與對照組比較，模型組大鼠手術(shù)側(cè)半球腦組織IL-10含量降低，IL-6和TNF-α含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉(zhuǎn)染組IIL-10含量升高，IIL-6和TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織TNF-α、IL-6和IL-10表達Tab.4 Expression of TNF-α, IL-6, and IL-10 in brain tissue of rats in each group

2.5 腦細胞的凋亡

與對照組比較，模型組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織切片 TUNEL陽性細胞數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉(zhuǎn)染組TUNEL陽性細胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表5。

對照組 模型組 模擬轉(zhuǎn)染組圖1 各組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織細胞凋亡水平(TUNEL染色)Fig.1 Apoptosis level of each group (TUNEL staining)

表5 TUNEL陽性細胞數(shù)Tab.5 Number of TUNEL positive cells

2.6 p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白表達

與對照組比較，模型組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織勻漿中 p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(S9)、p-c-Raf(Ser338)蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉(zhuǎn)染組p-AKT、p-GSK3β、p-c-Raf蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-130a促進了PI3K/AKT途徑的發(fā)生。見表6、圖2。

表6 各組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白表達Tab.6 Expression of p-AKT, p-GSK3β ,and p-c-Raf proteins in brain tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠手術(shù)側(cè)腦組織p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白的表達Fig.2 Expression of p-AKT, P-GSK3β, and p-c-Raf

3 討論

缺血性腦卒中是導(dǎo)致死亡的嚴重疾病，缺血性腦卒中血腫的數(shù)量和患者的并發(fā)癥是影響預(yù)后的重要因素，可用于評估患者的預(yù)后[12-14]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的流行病學(xué)調(diào)查，中風(fēng)導(dǎo)致的死亡人數(shù)在所有主要疾病中排名第二，中風(fēng)的特征是急性發(fā)作，高死亡率和許多并發(fā)癥[15]。中國已逐漸步入人口老齡化階段，中風(fēng)已成為第一大死亡原因。中風(fēng)具有較高的死亡率和致殘率，腦梗死后隨著空間的占用而迅速發(fā)生水腫，導(dǎo)致顱內(nèi)高壓和腦疝，并導(dǎo)致死亡[16]。miRNA是一組在體內(nèi)起調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA，其廣泛存在于許多真核生物中，與個體發(fā)育，能量代謝，細胞增殖和凋亡密切相關(guān)。miR-21和miR-181b等miRNA參與腦水腫的形成，其是影響中風(fēng)患者預(yù)后的重要因素[17]。miR-130a是一種抗血管生成的轉(zhuǎn)錄因子。miR-130a在具有短暫缺血性腦卒中的糖尿病大鼠中也起著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組缺血性腦卒中組織中miR-130a的表達降低，行為實驗結(jié)果表明模型組存在嚴重的神經(jīng)損傷。干預(yù)腦組織中miR-130a的表達后，神經(jīng)功能得以有效恢復(fù)，這說明miR-130a的高表達可能與缺血性腦卒中大鼠腦損傷密切相關(guān)。PTEN是具有磷酸酶活性的癌癥抑制基因，與細胞侵襲，遷移和凋亡有關(guān)[19]。PI3K是PTEN的最重要底物，是細胞增殖的重要信使，PTEN可特異性作用于PI3K來調(diào)節(jié)Akt的磷酸化。p-Akt可直接或間接調(diào)節(jié)凋亡蛋白的活性，從而干擾細胞增殖并阻止細胞周期，并最終導(dǎo)致凋亡[20]。PTEN磷酸化后，將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，磷酸酶活性將喪失。本研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中會升高腦組織中PTEN的磷酸化水平，從而抑制PI3K/Akt并導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元損傷。本研究中模型組腦組織神經(jīng)元凋亡水平升高，促炎因子IL-6和TNF-α水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，在模型miR-130a均下調(diào)，且miR-130a通過PTEN/PI3K/AKT信號通路保護了腦I/R損傷，為急性腦I/R損傷的診斷和治療提供了新思路。miR-130a與多種疾病有關(guān)，包括腫瘤和腦缺血性損傷。miR-130a在食管鱗狀細胞癌的腫瘤生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用。miR-130a在胃癌中被上調(diào)并促進血管生成和細胞生長。缺血性卒中患者血漿中miR-130a水平的降低與疾病風(fēng)險呈負相關(guān)。miR-130a在腦缺血損傷中的表達降低。據(jù)報道，抑制PTEN增加了PI3K/AKT軸的激活。PTEN可作為miR-21的靶標，可參與針對心肌損傷的保護作用。PTEN作為miR-130a的靶標，并推翻了miR-130a在腦I/R損傷中的神經(jīng)保護作用。除此之外，miR-130a過表達通過抑制PTEN增強了PI3K/AKT軸的激活。

綜上所述，miR-130a還可通過激活PI3K/AKT軸和抑制PTEN來防止缺血性卒中引起的神經(jīng)功能缺損。