◎ 姚 佳，陳開琴，黃希蓮，吳清美，梁 晨

（1.黔南民族師范學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.貴州省普通高校都勻毛尖茶工程研究中心，貴州 都勻 558000；3.遵義師范學(xué)院，貴州 遵義 563006）

咖啡堿又名1,3,7-三甲基黃嘌呤，是一種重要的黃嘌呤堿化合物?？Х葔A作為茶葉中的特征性成分，在茶樹中含量較高，具有興奮神經(jīng)、利尿、助消化、抗癌等功效[1]，但攝入過量的咖啡堿會對人體產(chǎn)生短期的負(fù)面作用，同時具有成癮性，長期服用中斷后，會產(chǎn)生如失眠、煩躁、頭痛等一系列綜合癥狀，一些特殊人群如孕婦、兒童、老年人、胃潰瘍患者均不能食用[2]。

速溶茶是一種能夠迅速溶解于水的固體飲料，以成品茶、半成品茶、茶葉副產(chǎn)物或鮮葉為原料，由于其易溶于熱水，制備的速溶茶中往往含有咖啡堿。近年來，低咖啡堿速溶茶的制備技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，常用技術(shù)有超臨界CO2流體萃取技術(shù)、微生物降解、熱水脫除、酶法制備、吸附劑吸附等[3-6]，根據(jù)咖啡堿與茶多酚易形成絡(luò)合物的性質(zhì)，降低茶湯中的咖啡堿含量[7]。本文擬通過加入茶多酚降低咖啡堿的方法制備速溶茶，研制出一種制作低咖啡堿速溶茶的方法，以期能降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

都勻毛尖（購自于貴州省黔南州境內(nèi)）；茶多酚 （純度98%，上海夢荷生物科技有限公司）；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（貴州迪大生物科技有限公司）；pH=7.5的磷鹽酸緩沖液，堿式乙酸鉛溶液（AR），酒石酸亞鐵溶液（AR）。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 60紫外可見光分光光度計（美國Agilent公司）、GZX-GF-101-2-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海賀德試驗(yàn)設(shè)備廠）、SHZ-DⅢ循環(huán)式多用真空泵（上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司）、BSS-110-S電子天平（京賽多斯天平有限公司）、GZX-GF-101-2-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海核德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱取咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品約0.200 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，作母液，準(zhǔn)確吸取1 mL母液，加水至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 mL含咖啡堿0.200 μg）。

1.3.2 供試溶液的準(zhǔn)備

稱取1 g（精確到0.001 g）研磨搗碎茶樣于250 mL 錐形瓶中，加沸蒸餾水80 mL，立即移入沸水浴45 min （每隔10 min搖勻1次），浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，濾液移入100 mL容量瓶中，殘留濾液用少量蒸餾水洗滌2～3次，移入上述容量瓶中，冷卻后用蒸餾水稀釋至刻度。

1.3.3 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)液曲線的繪制

吸取1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、 3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL和6.0 mL分別于25 mL容量瓶中，各加入1.0 mL鹽酸，蒸餾水定容，于波長274 nm處測吸光度（A），以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 咖啡堿脫除率計算

按照2.1.2方法制備供試品溶液，取供試品溶液，計算出樣品中咖啡堿的干態(tài)質(zhì)量：

式（1）中：ω-咖啡堿脫除率，%；W1-對照組咖啡堿含量，%；W2-試驗(yàn)組咖啡堿含量，%。

1.3.5 單因素考察

設(shè)計4個因素分別為浸提時間（A），浸提溫度（B），茶水比（C），茶多酚用量（D），并設(shè)計空白對照組，按1.3.4計算咖啡堿脫除率。

（1）浸提時間對咖啡堿脫除率的影響。稱取1 g（精確到0.001 g）茶樣研磨搗碎，按1.3.2方法，浸提溫度80 ℃，茶水比1∶100，茶多酚用量0.5 mg條件下，考察浸提時間分別為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min時對咖啡堿脫除率的影響。

（2）浸提溫度對咖啡堿脫除率的影響。稱取1 g （精確到0.001 g）研磨搗碎，按1.3.2方法，浸提時間45 min，茶水比1∶100，茶多酚含量0.5 mg條件下，考察浸提溫度分別為40 ℃、50 ℃ 、60 ℃、70 ℃、 80 ℃時對咖啡堿脫除率的影響。

（3）茶水比對咖啡堿脫除率的影響。稱取1 g（精確到0.001 g）研磨搗碎，按1.3.2方法，考察浸提時間45 min，浸提溫度80 ℃，茶多酚用量0.5 mg條件下，茶水比分別為1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200時對咖啡堿脫除率的影響。

（4）茶多酚用量對咖啡堿脫除率的影響?？疾旖釙r間45 min，浸提溫度60 ℃，茶水比1∶150，在此條件下，設(shè)計茶多酚用量0.1 mg、0.3 mg、0.5 mg、0.7 mg、1.0 mg對咖啡堿脫除率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.517 9c+0.101 7，R2=0.999 6，結(jié)果表明，在0～1.2 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素結(jié)果與分析

由圖2可知，浸提時間為45 min時，咖啡堿脫除率為25.29%；由圖3可知，浸提溫度為70 ℃時，咖啡堿的脫除率為29.25%，；由圖4可知，茶水比為1∶150時，咖啡堿的脫除率為30.75%，；由圖5可知，茶多酚的用量為0.7 mg時，咖啡堿的脫除率為40.60%。因此，選取浸提時間45 min，浸提溫度70 ℃，茶水比1∶150，茶多酚的用量0.7 mg為最佳條件。

圖2 浸提時間對咖啡堿脫除率的影響圖

圖3 浸提溫度對咖啡堿脫除率的影響圖

圖4 料液比對咖啡堿脫除率的影響圖

圖5 茶多酚用量對咖啡堿脫除率的影響圖

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9（34）正交試驗(yàn)表，提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、茶多酚用量（D）4個因素，每個因素設(shè)3個水平，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

取每份質(zhì)量為1 g的茶葉樣品9份，按正交設(shè)計表所列條件，1.3.2方法提取，按1.3.4方法計算速溶茶中咖啡堿脫除率，正交試驗(yàn)相關(guān)結(jié)果見表2。從表2正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響速溶茶中咖啡堿的因素依次為茶多酚用量＞浸提時間＞浸提溫度＞茶水比。試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A1B3C3D3，即浸提時間30 min，浸提溫度80 ℃，茶水比1∶200，茶多酚用量0.7 mg。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

方差分析見表3。由正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析可知，茶多酚用量對降低咖啡堿脫除率的差異性顯著。

表3 咖啡堿脫除率的方差分析表

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取茶葉1 g，共3份，按確定的最佳工藝條件進(jìn)行制備，并設(shè)空白對照組，驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，測定的速溶茶的平均咖啡堿脫除為47.30%。RSD為1.9%，說明該工藝重復(fù)性良好。

表4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)表

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)以及重復(fù)性檢驗(yàn)可以得出，制備低咖啡堿速溶茶的最佳組合為浸提時間30 min，浸提溫度80 ℃，茶水比1∶200，茶多酚用量0.7 mg；該組合可脫除茶湯中47.30%的咖啡堿含量。且RSD＜2%，重復(fù)性可靠，即該工藝具有較大的穩(wěn)定性，可作為生產(chǎn)工藝的參考。

與目前已在使用的各種降低茶葉中咖啡堿含量的技術(shù)相比，該技術(shù)具有一定的優(yōu)勢，雖然不及超聲波輔助可以提取出氨基酸含量高，但對茶多酚的浸出率相對較高；對比微波輔助法，具有水浸出物相對較高的優(yōu)勢。另外也有不足的地方，相信在科學(xué)不斷發(fā)展進(jìn)步的今天，會有相應(yīng)的方法來填補(bǔ)這些不足。