王瑩，李鋒濤，黃美子，陳毓，盧軍鋒，錢(qián)建中

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

黃精（Polygonatum sibiricum）別名土靈芝，為百合科黃精屬多種植物的干燥塊莖，主要分布于北溫帶和北亞熱帶。黃精富含多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等功能性成分，具有增強(qiáng)免疫功能、抑菌抗炎、降血糖、降血脂等功效，在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景[1-4]。黃精是一種藥食同源類(lèi)中藥材，常加入粥中熬制，也可蒸制后食用，除此之外，黃精還可加工為米酒、酸奶、發(fā)酵飲料等[5-8]。

速溶茶是在保證有效成分的基礎(chǔ)上，通過(guò)粉碎、浸提、過(guò)濾、濃縮和干燥等工藝過(guò)程，加工成的一種能夠迅速溶解的新型固體飲料，具有飲用方便、便于攜帶、容易保存等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前，已有關(guān)于青錢(qián)柳、桑椹、魚(yú)腥草等速溶茶產(chǎn)品的研究報(bào)道[10-12]，而黃精速溶茶的報(bào)道相對(duì)較少。念波等[13]以黃精為原料，乙醇為浸提劑，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為自變量，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)，得到的黃精速溶茶得率和多糖含量均較高，然而試驗(yàn)中浸提劑乙醇的加入雖能促使有效成分溶出量增多，但也有可能改變有效成分的結(jié)構(gòu)，從而影響效果。水煮中藥，其有效成分溶出量不多，但生物酶的加入有利于提高有效成分的溶出[14]。前期，課題組研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶（纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比=1∶1）所得的黃精多糖得率遠(yuǎn)高于單一酶法的黃精多糖得率，因此，為了進(jìn)一步提高黃精速溶茶的得率，本試驗(yàn)擬采用超聲輔助復(fù)合酶法浸提黃精速溶茶，考察液料比、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)黃精速溶茶得率的影響，通過(guò)響應(yīng)曲面法確定最佳工藝條件，旨在為黃精的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：江蘇中藥科技園，經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院李鋒濤博士鑒定為黃精。

葡萄糖對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆丁：上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（1.1×105U/g）、果膠酶（5×104U/g）：和氏璧生物科技有限公司；乙醇、硫酸、三氯化鋁（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC-DS2型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；LE204E電子天平：梅特勒-托利多有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；HK-02A多功能粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；TDL-5-A低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；GPW120-II噴霧干燥機(jī)：山東天力干燥股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精預(yù)處理

黃精在60℃下真空干燥，經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，所得黃精粉末密封貯藏，備用。

1.3.2 黃精速溶茶提取工藝

稱(chēng)取黃精粉末10 g于具塞錐形瓶中，按照一定的液料比加入一定濃度的復(fù)合酶溶液，在一定溫度下以200W的超聲功率酶解一定時(shí)間，再過(guò)濾，濾液于100℃水浴1 h滅酶，重復(fù)3次，合并3次濾液，冷卻、減壓濃縮后，加入2%麥芽糊精，170℃噴霧干燥，得黃精速溶茶，根據(jù)下列公式計(jì)算黃精速溶茶得率。

1.3.3 酶解法提取工藝對(duì)黃精速溶茶得率的影響

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

在加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比=1∶1）、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間30 min條件下，考察不同液料比[5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）]對(duì)黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g）、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間30 min條件下，考察不同加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對(duì)黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g），加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比=1∶1），酶解時(shí)間30 min條件下，考察不同酶解溫度（30、35、40、45、50℃）對(duì)黃精速溶茶得率的影響；在液料比20∶1（mL/g）、加酶量1.5%（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比=1∶1）、酶解溫度40℃條件下，考察不同酶解時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)黃精速溶茶得率的影響。每個(gè)試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化黃精速溶茶生產(chǎn)工藝

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，以黃精速溶茶得率為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)一步優(yōu)化黃精速溶茶生產(chǎn)工藝。分析因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 黃精速溶茶品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 黃精多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定黃精多糖含量[15]，以葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.0109x+0.0918，R2=0.9993，在10.88μg/mL～50.82μg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與其吸光度具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

根據(jù)下列公式計(jì)算多糖含量。

1.4.2 黃精中總黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用三氯化鋁顯色法測(cè)定黃精中總黃酮含量[16]。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.064 2x+0.165 8，R2=0.999 4，在 10.24 μg/mL～51.12 μg/mL 內(nèi)，蘆丁濃度與其吸光度具有良好線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)下列公式計(jì)算黃精黃酮含量。

1.4.3 黃精速溶茶感官評(píng)價(jià)

取0.75 g黃精速溶茶，在自然光線(xiàn)下觀(guān)察色澤和外觀(guān)形態(tài)，分別取30、60、100℃的250 mL蒸餾水沖泡，觀(guān)察溶解性、滋味和氣味等變化，并進(jìn)行評(píng)定。

1.5 黃精速溶茶抗氧化活性研究

1.5.1 DPPH自由基清除力測(cè)定

參照Shimada等[17]方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黃精速溶茶水溶液，精密移取1.00 mL不同濃度黃精速溶茶水溶液于比色管中，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，置于暗處30 min，測(cè)定吸光度。以樣品溶劑為空白，測(cè)定其上清液在515 nm波長(zhǎng)處吸光度A，同時(shí)測(cè)定在515 nm處樣品溶液吸光度A0及DPPH甲醇溶液吸光度A1[18]，平行測(cè)定3次，求平均值。按下式計(jì)算黃精速溶茶DPPH自由基清除率。

1.5.2 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

參照伏有為等[19]的方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黃精速溶茶水溶液，準(zhǔn)確移取1.00 mL不同濃度的黃精速溶茶水溶液于比色管中，加入 4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）和2 mL 20 mmol/L鄰苯三酚溶液，水浴反應(yīng)15 min，加入2 mL 1%HCl溶液，以蒸餾水為空白在325 nm處測(cè)定吸光度Ax，空白對(duì)照組吸光度A0，平行測(cè)定3次，求平均值。按下式計(jì)算黃精速溶茶超氧陰離子自由基清除率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)黃精速溶茶得率的影響

液料比對(duì)黃精速溶茶得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)黃精速溶茶得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖1可知，隨著液料比的增加，黃精速溶茶得率先升高后下降，當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，黃精速溶茶得率達(dá)到26.29%，這可能是由于隨著液料比的增加，黃精細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大，有利于多糖、黃酮等有效成分浸出，但當(dāng)液料比過(guò)高時(shí)，可能減小了黃精有效成分與酶的接觸，影響黃精速溶茶的得率[18]。因此，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)液料比設(shè)置為20∶1（mL/g）。

2.1.2 加酶量對(duì)黃精速溶茶得率的影響

加酶量對(duì)黃精速溶茶得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 加酶量對(duì)黃精速溶茶得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖2可知，當(dāng)加酶量為0.5%～1.5%時(shí)，黃精速溶茶得率逐步增加，之后趨于穩(wěn)定。這可能是由于隨著加酶量的增加，酶與黃精有效成分的結(jié)合點(diǎn)增多，加速細(xì)胞壁的溶解，有利于多糖、黃酮等有效成分的浸出。因此，后續(xù)加酶量選擇1.5%左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 酶解溫度對(duì)黃精速溶茶得率的影響

酶解溫度對(duì)黃精速溶茶得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)黃精速溶茶得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖3可知，隨著酶解溫度的上升，黃精速溶茶得率先上升，之后有所下降。這可能是因?yàn)闇囟壬吣軌虼龠M(jìn)酶解作用，且細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)分子的擴(kuò)散速度也會(huì)加快，有利于多糖、黃酮等有效成分的溶出[20]，但當(dāng)溫度超過(guò)45℃時(shí)，黃精速溶茶得率略微下降，這可能是因?yàn)槊糠N酶都有最適宜的溫度，其中果膠酶和纖維素酶的最適溫度在40℃～50℃，故溫度過(guò)高，會(huì)影響酶解作用[21]。因此，后續(xù)酶解溫度選擇45℃左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)黃精速溶茶得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)黃精速溶茶得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)黃精速溶茶得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖4可知，當(dāng)酶解時(shí)間由10 min增加到40 min時(shí)，黃精速溶茶得率增加，之后略有下降。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解反應(yīng)逐漸進(jìn)行完全，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，黃精多糖、黃酮等有效成分浸出量最多，速溶茶得率達(dá)到最大。因此，后續(xù)酶解時(shí)間選擇40 min左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 黃精速溶茶得率的數(shù)學(xué)模型建立

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，以黃精速溶茶得率為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Design and results of response surface test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

通過(guò)Design-Expert10.0.3軟件分析模型，擬合得到黃精速溶茶得率回歸方程：得率Y=27.49+2.04A+1.18B+0.34C+0.245D+0.44AB-0.46AC-0.43AD+0.46BC-0.035BD-0.24CD-4.51A2-2.18B2-2.36C2-1.35D2。

由表3可知，建立的模型具有較高的F值（38.13），較低的P值（P＜0.01），說(shuō)明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.261 2＞0.05，不顯著，說(shuō)明模型適合本試驗(yàn)，可用于黃精速溶茶提取工藝優(yōu)化。該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.974 4，校正后系數(shù)R2Adj=0.948 9，說(shuō)明該模型能解釋94.89%的響應(yīng)變化。A、B、A2、B2、C2、D2對(duì)速溶茶得率影響差異極顯著（P＜0.01），由F值得到影響因素主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即液料比＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。

2.2.2 黃精速溶茶工藝的響應(yīng)面分析

黃精速溶茶工藝的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互影響黃精速溶茶得率的曲面圖Fig.5 Surface graph of factor interactions on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea

響應(yīng)面的陡峭程度反映了不同因素對(duì)黃精速溶茶得率的影響程度，響應(yīng)面越陡，說(shuō)明該因素對(duì)結(jié)果的影響越大，反之對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響小[22]。由圖5可知，黃精速溶茶得率隨著液料比的增加，先急劇上升后下降，響應(yīng)曲面最陡，說(shuō)明液料比對(duì)黃精速溶茶得率影響最大，之后影響因素依次為加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面法建立的模型預(yù)測(cè)黃精速溶茶最佳酶解工藝為液料比20.737∶1（mL/g）、加酶量1.369%、酶解溫度46.876℃、酶解時(shí)間37.373 min，此條件下，得率為26.82%，考慮實(shí)際操作的可控性，將上述最優(yōu)酶解工藝修正為液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間37 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測(cè)定3次，黃精速溶茶平均得率為26.08%，與預(yù)測(cè)值26.82%較為接近，表明該模型能夠預(yù)測(cè)黃精速溶茶的提取工藝，模型可靠。

2.3 黃精速溶茶品質(zhì)測(cè)定

2.3.1 感官評(píng)審

最佳酶解工藝條件下干燥后得到的黃精速溶茶，其感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表4。

表4 黃精速溶茶感官評(píng)價(jià)Table 4 Sensory evaluation of Polygonatum sibiricum instant tea

2.3.2 不同沖泡溫度對(duì)黃精速溶茶溶解性影響

取0.75 g最佳酶解工藝條件下的黃精速溶茶，分別加入250 mL的30、60、100℃蒸餾水沖泡，沖泡溫度對(duì)黃精速溶茶溶解性的影響見(jiàn)表5。

表5 沖泡溫度對(duì)黃精速溶茶溶解性影響Table 5 Effect of brewing temperature on the solubility of Polygonatum sibiricum instant tea

2.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

最佳酶解工藝條件下黃精速溶茶中的黃精多糖含量為3.73%，黃酮含量為0.95%。

2.4 黃精速溶茶抗氧化活性分析

黃精速溶茶對(duì)自由基的清除率見(jiàn)圖6。

圖6 黃精速溶茶對(duì)自由基的清除率Fig.6 Free radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum instant tea

由圖6可知，黃精速溶茶對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，且清除率隨著黃精速溶茶濃度的增加而增大，之后趨于穩(wěn)定，當(dāng)黃精速溶茶濃度達(dá)到20.00 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力分別達(dá)到62.18%和55.15%，黃精速溶茶對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的半清除率IC50分別為14.34 mg/mL和16.45 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

浸提是速溶茶加工中最關(guān)鍵的工序之一，超聲輔助復(fù)合酶法具有浸提速度快、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)有效活性成分高效提取。耿麗晶等[21]通過(guò)復(fù)合酶輔助法制備速溶普洱茶，得出最佳工藝參數(shù)為復(fù)合纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶=1∶1∶1，酶添加量為0.75%，酶解溫度為45℃，酶解60 min，茶水比為1∶12（g/mL），浸提2次，產(chǎn)品平均得率為26.23%。王家健等[23]比較了速溶茶酶法提取工藝和傳統(tǒng)沸水浸提工藝，結(jié)果表明酶法制備的速溶茶更多地保留了茶葉中的有效成分。

本試驗(yàn)采用黃精做原料，利用超聲輔助復(fù)合酶法浸提制成黃精速溶茶，通過(guò)響應(yīng)曲面法確定最佳工藝條件為液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間37 min，此條件下，黃精速溶茶平均得率26.08%。所得產(chǎn)品為黃色粉末，在沸水中全部溶解，具有原藥材香味，微甜。該茶飲用方便，適合人們快節(jié)奏的生活方式。然而，本試驗(yàn)所得黃精速溶茶的得率不高，這可能是由于速溶粉受潮導(dǎo)致粘壁。今后，將進(jìn)一步研究速溶茶的最佳噴霧干燥技術(shù)，為黃精資源的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新途徑。