喬妙 朱朋艷 趙云麗 黃艷蘋 吳凡 高文分 盛軍 袁文娟 王宣軍

摘要 [目的]建立一種LC-MS/MS測定大鼠血漿中EGCG濃度的方法，進而研究其藥動學。[方法]選用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（90∶10）為流動相，等度洗脫，ESI離子源，多反應離子監(jiān)測，負離子掃描;以香草醛為內(nèi)標，采用內(nèi)標法定量。[結(jié)果]EGCG和內(nèi)標不受基質(zhì)干擾;定量限分別為10 ng/mL（EGCG）和5 ng/mL（香草醛），血漿樣品批內(nèi)和批間精密度（RSD）≤11.5%，準確度在92.0%～118.9%，萃取回收率≥92.7%，基質(zhì)效應為95.3%～115.3%，大鼠腹腔注射20 mg/kg EGCG后的血漿動力學符合二室模型，消除半衰期較長，表觀分布容積（Vd）大于總體水體積。[結(jié)論]該方法重現(xiàn)性好、分析時間短，能滿足EGCG在大鼠血漿中濃度的檢測要求，并符合《中國藥典》2015年版對生物樣品分析的要求，可用于大鼠血漿中EGCG的濃度測定和藥代動力學研究。

關鍵詞 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;EGCG;大鼠血漿;濃度;藥代動力學

中圖分類號 R 285 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）14-0172-04

Abstract [Objective] To establish a LC-MS/MS method to determine the concentration of EGCG in rat plasma and to study its pharmacokinetics.[Method]Choose Agilent SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），acetonitrile-water （90∶10） as mobile phase，isocratic elution，ESI ion source，multireactive ion monitoring，negative ion scanning.Vanillin was used as the internal standard，and the internal standard method was used for quantification.[Result] In this method，detection of EGCG and IS were not interfered by the matix，LOQ were 10 ng/mL （EGCG） and 5 ng/mL（vanillin） respectively，the intraassay and interassay precision （RSD） of plasma samples was ≤11.5%，the accuracy was 92.0%-118.9%，and the extraction recovery rate ≥92.7%，ME was 95.3%-115.3%.After injection of 20 mg/kg EGCG，the plasma dynamics of EGCG was in accordance with the two compartment model，the apparent volume of distribution （Vd） values of EGCG was larger than total body water volume.[Concusion]This method has good reproducibility and short analysis time，can meet the detection requirements of EGCG concentration in rat plasma，and meets the requirements for the analysis of biological samples in the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia，which can be applied to the pharmacokinetic study of EGCG in rats.

Key words HPLC-MS/MS;EGCG;Rat plasma;Concentration;Pharmacokinetic

基金項目

國家自然科學基金項目（32060084）;云南省應用基礎研究項目（2019FB119）;國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃支持項目（202010676050）。

作者簡介 喬妙（1997—），女，貴州畢節(jié)人，碩士研究生，研究方向：功能食品。*通信作者：袁文娟，副主任藥師，博士，從事食品藥品研究;王宣軍，教授，博士，博士生導師，從事食品研究與開發(fā)工作。

收稿日期 2021-01-04

EGCG是綠茶中含量最高、活性較強的多羥基酚類化合物，占40%以上，屬于兒茶素中的一類[1- 4]，具有抗氧化和自由基清除的功能，有助于治療和清除某些類型的癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和肥胖[5-10]。因此，EGCG作為茶中重要的多酚類物質(zhì)具有重要的研究價值。

目前，EGCG的研究是綠茶開發(fā)的熱點和焦點[11-15]，但多集中在生物活性的研究上，國內(nèi)外關于EGCG藥動學的研究較少，且集中在茶多酚、給藥途徑為口服的研究上，檢測方法多為HPLC-UV和HPLC-RID，這2種方法靈敏度低、專屬性差，導致測定結(jié)果不準確[16]。云南農(nóng)業(yè)大學普洱茶教育部重點實驗室長期致力于EGCG的研究，此次試驗建立一種簡單、可靠、重現(xiàn)性好的檢測方法，對其非臨床藥動學研究、毒動學研究具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。LC-30A液相色譜系統(tǒng)（配有四元梯度泵、在線脫氣機，日本島津公司）;API 5500型液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子化源（ESI源），美國AB公司）;BS224S分析天平（德國Sartorius）;LX-500型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;ST-16R高速冷凍離心機（Thermo Fisher公司）;SK-18TC超聲波發(fā)生器 （上?？茖С晝x器有限公司）。

1.1.2 試藥。EGCG（批號180705，含量>99.0%，HPLC法測定，含量按100%計，上海友思生物技術有限公司）;香草醛（AR，含量>99.0%，批次20191020，aladdin）;（+）-L-抗壞血酸（VC，含量99%，批次LC80Q50，北京百靈威科技有限公司）;乙二酸四乙胺二鈉（EDTA-2Na，AR級，批次20191020，天津市大茂化學試劑廠）;乙酸乙酯（EtoAc，分析純）;甲醇（CH3OH，分析純）;乙腈（CH3CN，HPLC級，美國TEDIA公司）;水為純凈水;其余試劑均為分析純。

1.1.3 動物。SPF級SD大鼠10只，雌雄各半，體重180～200 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2015-030。飼養(yǎng)條件：室溫（25±2） ℃，相對濕度為（50±10）%，每日交替12 h光照，自由飲水。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠藥動學試驗。大鼠10只，試驗前12 h禁食，自由飲水，給藥前用無菌生理鹽水配制成適當濃度的EGCG溶液，腹腔注射，給藥劑量20 mg/kg。于給藥前及給藥后5、10、20、45、90、120、180、360 min，從大鼠眼后靜脈叢取血，置肝素化1.5 mL離心管中，低溫離心，分離得血漿樣品。于-80 ℃凍存，備用。

1.2.2 血液樣品預處理。取大鼠血漿樣品50 μL，精密加入0.2%VC-0.005%EDTA-2Na 10 μL、香草醛（5.0 μg/mL）10 μL，混勻，分別用乙酸乙酯200、100 μL漩混1 min，萃取2次，4 ℃低溫離心5 min，合并乙酸乙酯層，45 ℃以下吹干，用10%乙腈水溶液200 μL，漩混1 min，低溫離心5 min，取上清液進行LC-MS分析。

1.2.3 溶液的配制。

1.2.3.1 對照品儲備液及工作液的配制。精密稱取EGCG標準品適量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.218 mg/mL的標準品儲備液，取EGCG儲備液，用甲醇梯度稀釋，得到系列對照品工作液，EGCG濃度分別為109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL;儲備液置于-20 ℃保存，工作液臨用時現(xiàn)配，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 內(nèi)標香草醛（IS）溶液的配制。精密稱取香草醛標準品適量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.500 mg/mL的標準品儲備液，再用甲醇稀釋100倍得5.0 μg/mL內(nèi)標溶液。

1.2.4 色譜條件與質(zhì)譜條件。色譜柱為Agilent SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流動相為乙腈-水（90∶10）;流速0.5 mL/min;進樣量1 μL;柱溫為室溫;離子源為ESI;負離子掃描，MRM監(jiān)測;電噴霧電壓-40 eV;用于定量分析的離子反應： m/z ?457.3→168.9（EGCG）， m/z ?150.9→135.6（內(nèi)標香草醛），見圖1。

1.2.5 方法學考察。

1.2.5.1 專屬性考察。取大鼠空白血漿50 μL，用甲醇10 μL代替內(nèi)標溶液，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件測定得空白血漿質(zhì)譜圖;另取空白血漿50 μL，精密加入EGCG對照品溶液（1.09 μg/mL）和內(nèi)標溶液10 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件測定得相應質(zhì)譜圖;另取腹腔注射后空白血漿50 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件測定得相應質(zhì)譜圖。

1.2.5.2 標準曲線的繪制和定量限、檢出限。精密量取50 μL大鼠空白血漿7份，分別加入109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL EGCG標準品溶液各10 μL，IS溶液（內(nèi)標，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進行測定，以EGCG的濃度為橫坐標 （x）、 EGCG與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標 （y）， 用加權最小二乘法（權重為1/ x2）進行回歸運算，求得的直線方程即為標準曲線。以S/N>10、S/N>3 分別測得EGCG和內(nèi)標（香草醛）的定量限和檢出限。

1.2.5.3 精密度和準確度。分別取0.218、0.872、2.180、87.200 μg/mL的EGCG標準品溶液10 μL，加入空白血漿50 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進行測定，每個濃度6個平行樣品，以標準曲線計算EGCG的濃度，并計算批內(nèi)準確度和精密度;連續(xù)處理3個分析批，計算批間準確度和精密度。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗。分別取0.218、87.200 μg/mL的EGCG標準溶液10 μL，加空白血漿50 μL，再加入空白基質(zhì)提取液，渦旋混勻后檢測，每一個濃度6個平行樣本，分別考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性（-80 ℃和室溫凍融循環(huán)3次）、室溫短期6 h穩(wěn)定性、長期30 d穩(wěn)定性（-80 ℃長期存放）和樣品制備后24 h自動進樣器穩(wěn)定性（5 ℃）。

1.2.6 稀釋效應。制備21.8 μg/mL的血漿樣本，用空白血漿稀釋5倍后取10 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進行測定，平行測定6個樣本。

1.2.7 殘留。取空白血漿20 μL，按“1.2.2”方法進行提取，制備得到殘留樣本，在標準曲線最高點樣本進樣后進樣殘留樣本。

1.2.8 回收率與基質(zhì)效應。分別取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的標準溶液10 μL，IS溶液（內(nèi)標，5 μg/mL）10 μL，再加入空白基質(zhì)提取液，渦旋混勻后檢測，每一個濃度6個平行樣本，峰面積記為Set1;分別取0.218、2.180、87.200 μg/mL的EGCG標準溶液，加入空白血漿50 μL，渦旋混勻后，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進樣分析，每一個濃度6個平行樣本，峰面積記為Set2;回收率按Set2/Set1計算。

分別取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的標準溶液10 μL，IS溶液（內(nèi)標，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進樣分析，每一個濃度6個平行樣本，峰面積記為Set3;基質(zhì)效應按Set1/Set3計算。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析及藥動學研究。給藥數(shù)據(jù)采用對血藥濃度（C）-時間（T）數(shù)據(jù)進行房室模型的判定及 t 1/2z、AUC、CL和Vd等藥動學參數(shù)的計算。所有數(shù)據(jù)均表示為 ±S ，應用SPSS 11.5進行統(tǒng)計學分析，通過 t 檢驗進行顯著性判定，如 P <0.05，則認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

取-80 ℃存放的大鼠血漿樣品，室溫解凍，精密吸取50 μL 置1.5 mL離心管中，按“1.2.2”方法進行提取，按“1.2.4”色譜條件進樣分析，根據(jù)標準曲線計算樣本的濃度，大鼠腹腔注射EGCG后各時間點所測得的血藥濃度-時間曲線，血藥濃度和時間數(shù)據(jù)采用DAS 3.2（drug and statistics）計算藥動學參數(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性考察。由圖2可見，EGCG和內(nèi)標的保留時間分別為8.78、9.89 min，兩者之間達到基線分離;空白血漿中雜質(zhì)峰均在兩者之前出現(xiàn)，不干擾EGCG和內(nèi)標IS的含量測定，給藥之后血漿樣品的圖譜中未見代謝物干擾，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾EGCG和內(nèi)標的測定。

2.1.2 標準曲線的建立和定量限、檢出限。 按照“1.2.5.2”方法操作，以EGCG的濃度為橫坐標（ x ）、EGCG與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標（ y），用加權最小二乘法（權重為1/x2）進行回歸運算，求得的回歸方程為y=4 094.174 83x+11 313.197 16（r =0.993 4），表明EGCG在5.45～5 450.00 ng/mL 線性關系良好。以 S/N >10測得EGCG和內(nèi)標（香草醛）的定量限分別為10和5 ng/mL，以 S/N >3測得EGCG和香草醛的檢出限均為1 ng/mL。

2.1.3 精密度和準確度。按照“1.2.5.3”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），批內(nèi)和批間準確度在92.0%～118.9%，RSD≤11.5%，符合《中國藥典》2015年版對生物樣本的檢測要求。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.5.4”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），RSD≤10.7%，符合藥典測定要求，表明供試品在-80 ℃和室溫凍融循環(huán)3次、室溫6 h、-80 ℃存放30 d、自動進樣器24 h（5 ℃）基本穩(wěn)定。

2.2 稀釋效應 按照“1.2.6”方法操作，平行測定6個樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)準確度均值為87.5%，精密度（RSD）為5.8%，說明高濃度血漿樣本經(jīng)過5倍稀釋不影響待測物的準確定量。

2.3 殘留 在標準曲線最高點樣本進樣后進樣殘留樣本，結(jié)果表明殘留樣本峰面積小于定量下限峰面積的20%，符合要求。

2.4 回收率與基質(zhì)效應 從表3可以看出，EGCG的萃取回收率在92.7%～114.5%;基質(zhì)效應在95.3%～115.3%。結(jié)果表明，EGCG在各濃度下提取回收率一致，基質(zhì)因子符合要求。該方法準確度高、重現(xiàn)性好。

2.5 數(shù)據(jù)分析與藥動學結(jié)果 大鼠腹腔注射EGCG后各時間點所測得的血藥濃度-時間曲線見圖3，血藥濃度和時間數(shù)據(jù)采用DAS 3.2計算藥動學參數(shù)，主要藥動學結(jié)果見表4，大鼠腹腔注射EGCG（20 mg/kg）后的血漿動力學符合二室模型，消除半衰期較長，表觀分布容積（Vd）大于總體水體積。

3 討論與結(jié)論

該研究分別考察了不同的流動相和色譜柱，優(yōu)選了分析條件，此色譜條件下EGCG和內(nèi)標（香草醛）峰形較好，出峰時間適中，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物，且可以準確定量;血漿樣本處理采用了液液萃取的方法，方法簡便易行，能達到較高的響應且不具有基質(zhì)效應，能滿足高通量分析要求。血漿樣本用量少，且靈敏度高;按常規(guī)方法對方法學的專屬性進行考察，采用質(zhì)控樣品對精密度、準確度、樣品存放穩(wěn)定性等進行方法學驗證，均符合《中國藥典》2015年版對生物樣品分析的要求。

該研究建立了LC-MS/MS測定大鼠血漿中EGCG的分析方法，該方法快速、靈敏、準確，符合生物樣品分析方法的指導原則的要求，并成功地應用到腹腔注射給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動學研究，獲得了藥動學的參數(shù)。結(jié)果表明，EGCG在大鼠體內(nèi)的藥物變化趨勢符合腹腔注射藥動學的特點，具有分布迅速、給藥頻次低的特點。該研究結(jié)果為進一步研究EGCG藥動-藥效學性質(zhì)提供了參考依據(jù)和技術保障。

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