江飛鳳，胡鵬剛，田太江，譚曉輝，潘雪梅，閆錦

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025）（2.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷 564500）（3.荔波昌輝食業(yè)有限公司，貴州荔波 558400）

柚子（Pomelo）是蕓香科植物，原產(chǎn)于東南亞的柑橘類水果，被認(rèn)為是膳食纖維和抗氧化材料的良好來源，具有“天然水果罐頭”的美稱[1,2]。柚子的營養(yǎng)成分豐富，富含糖類、維生素、礦物質(zhì)、類黃酮，具有健脾、潤(rùn)肺、補(bǔ)血、清腸、利便等功效，其果肉中含有類似胰島素成分的鉻和生物活性物質(zhì)生物苷，具有降低血液黏稠度，減少血栓形成，對(duì)腦血栓、腦卒等腦血管疾病有較好的預(yù)防作用和防止心臟心血管破裂等藥用價(jià)值[3-6]。釀造的柚子酒營養(yǎng)價(jià)值高，含有 17種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等有益微量元素，具有飲用滋補(bǔ)雙重作用[7,8]，其果香優(yōu)雅怡人、酒香濃郁、口感純正、清香舒適。此外，據(jù)研究報(bào)道柚子皮中含有多種生理活性成分[9]，如黃酮、多糖、香精油、類檸檬苦素、膳食纖維等[10]，提取的活性成分可用于制藥品及保健食品的開發(fā)[11]。

目前，對(duì)于柚子深加工開發(fā)技術(shù)較少，基本只當(dāng)做鮮果供食用，其柚皮一般也作為垃圾處理，不但對(duì)環(huán)境造成了很大程度的污染還導(dǎo)致資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[5]。柚子的利用存在著一些技術(shù)上的難題，其中的難題之一有柚子經(jīng)加工過程中苦味物質(zhì)難以去除，嚴(yán)重影響柚子酒的質(zhì)量和價(jià)值。而柚子中的苦主要來自于以柚皮苷、新橙皮苷等為代表的黃烷酮糖苷類化合物，以及檸檬苦素和諾米林為代表的高度氧化的四環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物檸檬苦素類似物所造成[12]。在柚子酒釀造過程中，對(duì)果實(shí)剝皮去籽處理，可有效控制原料本身具有的苦味物質(zhì)。但它們?cè)趦?chǔ)存一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生延遲苦味[13]，除此，對(duì)柚子果肉進(jìn)行的預(yù)處理以及柚子酒發(fā)酵和陳釀過程中形成的苦味物質(zhì)是復(fù)雜且不易控制的，不僅含有原料本身帶來的苦味，還有產(chǎn)苦味雜菌等微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生的苦味。據(jù)研究，柚皮苷酶能夠水解柚皮苷、新橙皮苷等糖苷，這些特性使該酶成為柑橘類脫苦商業(yè)化應(yīng)用的理想候選酶[14]。

目前國內(nèi)外均未見關(guān)于柚子酒的脫苦工藝研究，選擇對(duì)柚子酒進(jìn)行脫苦研究原因是酒廠生產(chǎn)的柚子低度果酒存在苦澀味道的問題，為了解決產(chǎn)品問題，開展了柚子酒脫苦研究。為進(jìn)一步得到不具苦澀味的柚子酒，本實(shí)驗(yàn)對(duì)柚子酒酶法脫苦工藝進(jìn)行研究探討，并對(duì)脫苦前后柚子酒風(fēng)味成分進(jìn)行分析探討。首先，為準(zhǔn)確探究柚子酒釀造過程中苦味物質(zhì)含量的變化，本文從柚子酒發(fā)酵到陳釀過程進(jìn)行了跟蹤分析，測(cè)定苦味物質(zhì)含量的變化情況，采用柚苷酶酶法脫苦技術(shù)優(yōu)化其釀造工藝，降低柚子酒中苦味物質(zhì)含量，同時(shí)應(yīng)用頂空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行研究，感官評(píng)價(jià)以及香氣成分熱圖差異分析來評(píng)價(jià)柚苷酶脫苦方法對(duì)酒體的影響，判斷柚苷酶對(duì)柚子酒脫苦方法的可行性。實(shí)驗(yàn)解決了柚子酒中嚴(yán)重苦味這一問題，并為柚子酒脫苦工藝技術(shù)提供了一定的理論支持，改善了柚子酒的品質(zhì)，為柚子酒產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益做出了一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚苷酶：青島優(yōu)順發(fā)生物科技有限公司。

酒樣：貴州荔波柚子酒，2019年貴州荔波昌輝食業(yè)生產(chǎn)。

試劑：氫氧化鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硫酸，重慶川江化學(xué)試劑廠；硫酸鎂、二甲氨基苯甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷，西隴化工股份有限公司；二甘醇，西隴科學(xué)股份有限公司；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈，阿拉??；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

723 -可見分光光度計(jì)，天津冠澤科技有限公司；YM-060ST超聲清洗機(jī)，深圳市方奧微電子有限公司；離心機(jī)、HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取纖維頭，美國 Supelco公司；Agilent 19091F-433 HP-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱，美國J&W Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柚苷酶脫苦單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)研究柚苷酶添加量（0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L）、酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶解時(shí)間（15、30、45、60、75、90、105 min）、pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）對(duì)柚子酒中苦味物質(zhì)去除率的影響。重復(fù)3次平行試驗(yàn)，取其平均值。固定單因素條件為柚苷酶用量2 g/L、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min、pH 3.5。

1.3.2 柚子酒中苦味物質(zhì)提取及質(zhì)量濃度測(cè)定

檸檬苦素類似物提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照畢靜瑩[15]的方法做了微調(diào)，以吸光度對(duì)檸檬苦素的質(zhì)量濃度繪制曲線得y=8.02x，R2=0.9992，并用來測(cè)定柚子酒中檸檬苦素類似物的質(zhì)量濃度。柚皮苷提?。阂迫?5 mL柚子酒，添加無水乙醇5 mL，搖勻，4000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，添加7 mL的50%乙醇成為樣液，備測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參考徐慧玨[12]的方法進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度對(duì)柚皮苷質(zhì)量濃度作圖得y=0.0049x+0.0151，R2=0.997。

1.3.3 脫除率的計(jì)算

式中：C0為脫苦處理前柚子酒中柚皮苷含量（mg/L）、檸檬苦素類似物含量（mg/mL）；C1為脫苦處理后柚子酒中柚皮苷含量（mg/L）、檸檬苦素類似物含量（mg/mL）。

1.3.4 總糖含量測(cè)定

為判斷柚子酒發(fā)酵的進(jìn)程及是否完全結(jié)束，對(duì)實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行總糖測(cè)定分析。按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]中的斐林試劑直接滴定法測(cè)定總糖含量。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以柚苷酶酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶添加量（C）和 pH（D）四因素作為影響因素，以柚子酒中柚皮苷脫除率（Y1）、檸檬苦素脫除率（Y2）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)確定柚子酒脫苦最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素與水平詳見表1所示。

表1 試驗(yàn)自變量因素與水平Table 1 Experimental independent variable factors and levels

1.3.6 柚子酒的感官鑒定

柚子酒的感官鑒定分析對(duì)于判定酒的品質(zhì)和風(fēng)味至關(guān)重要，感官評(píng)分結(jié)果由1名國家專業(yè)品酒評(píng)審委員和4名從事酒行業(yè)的專業(yè)工作人員進(jìn)行品評(píng)打分。評(píng)定分?jǐn)?shù)范圍為0~5，0分為未品嘗和未聞到香氣，5分為嘗到的苦味最強(qiáng)和聞到的香氣最強(qiáng)，在 20±1 ℃的溫度條件下進(jìn)行感官評(píng)定[17]，取所得均值作感官評(píng)分平面雷達(dá)圖。

1.3.7 香氣成分的提取

精密量取混勻樣品3 mL，精密加入混標(biāo)（環(huán)己酮1.54 μg/mL，壬酸甲酯 0.83 μg/mL）2 μL，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有 2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250 ℃）中，熱解析1 min進(jìn)樣。

1.3.8 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

色譜條件：初始溫度 40 ℃（保留 2 min），以3 ℃/min升溫至181 ℃，再以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持8 min，運(yùn)行時(shí)間：64.8 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓6.91 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流，溶劑延遲時(shí)間為1 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1717 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29~500 u。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定 3次并取平均值，利用 Origin 2018軟件作圖；應(yīng)用正交設(shè)計(jì)助手II軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行差異顯著性（p<0.05）及方差分析；GC-MS技術(shù)對(duì)揮發(fā)性成分定性：對(duì)總離子流色譜圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì) Wiley275和 Nist 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖確定揮發(fā)性成分的種類，經(jīng)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子酒在釀造與陳釀過程中檸檬苦素類似物含量的變化規(guī)律

在柚子酒中人們對(duì)檸檬苦素類似物的苦味閾值較為敏感，跟蹤檢測(cè)檸檬苦素類似物更具有代表性。圖1顯示柚子酒釀造過程中檸檬苦素類似物、總糖含量和溫度的變化情況。隨著發(fā)酵進(jìn)行，總糖含量一直呈下降趨勢(shì)；溫度先上升，到第4 d達(dá)到發(fā)酵旺盛階段，后下降且趨于平穩(wěn)；而檸檬苦素類似物含量呈波動(dòng)性變化，1～4 d呈上升趨勢(shì)，第4 d達(dá)到最高值，由于柚汁中無苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯（Limonin A-ring lactone）被檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)酯水解酶轉(zhuǎn)化為具有苦味的檸檬苦素類似物導(dǎo)致。隨后下降明顯，第7 d降到最低值，而后又出現(xiàn)上升趨勢(shì)，14 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值，可見發(fā)酵過程中生成的某些物質(zhì)能促使檸檬苦素類似物的分解和轉(zhuǎn)化，且是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程。

圖1 柚子酒發(fā)酵過程中溫度、總糖和檸檬苦素類似物含量的變化Fig.1 Changes of temperature, total sugar and limonin analogues during the fermentation of pomelo wine

發(fā)酵結(jié)束后，將柚子酒貯藏于常溫下，經(jīng)過15 d、45 d、75 d、105 d、135 d、165 d、195 d 陳釀后，取樣進(jìn)行檸檬苦素類似物含量的檢測(cè)。如圖2所示，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素類似物含量呈下降趨勢(shì)，可能是酒體中的某些物質(zhì)將檸檬苦素類似物吸附、下膠沉淀或是轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，但經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)半年以上的陳釀時(shí)間，其含量為 17.08 mg/L比最初含量降低了44.71%，但此時(shí)檸檬苦素類似物的含量還遠(yuǎn)高于閾值6 mg/L[18]?？梢姡L(zhǎng)時(shí)間的陳釀對(duì)于柚子酒中苦味的降低雖起到很大的作用，但是他需要很長(zhǎng)的時(shí)間陳釀，因此從節(jié)約經(jīng)濟(jì)、縮短陳釀時(shí)間、利潤(rùn)最大化等方面來考慮，將柚子酒進(jìn)行脫苦就非常有意義。

圖2 柚子酒陳釀過程中檸檬苦素類似物含量的變化Fig.2 Changes of limonin analogue content in pomelo wine during aging

2.2 柚苷酶脫苦處理單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3a可知，在酶解溫度30~60 ℃范圍內(nèi)，柚皮苷、檸檬苦素脫除率隨著溫度的升高而增大，當(dāng)酶解溫度為 60 ℃時(shí)，柚皮苷含量從未經(jīng)任何處理的165.69 mg/L下降到81.92 mg/L、檸檬苦素含量從17.08 mg/L下降到 10.91 mg/L，脫除率達(dá)到最大值分別為50.56%、36.12%。而后出現(xiàn)隨著酶解溫度的升高，柚皮苷和檸檬苦素脫除率呈下降趨勢(shì)，原因是溫度升高酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變性而導(dǎo)致柚苷酶活性降低或消失，從而脫苦能力降低。因此，選擇酶解溫度為 60 ℃，這與劉偉[19]酸橙汁進(jìn)行脫苦選擇的溫度一致。

圖3 酶解溫度（a）、酶解時(shí)間（b）、酶添加量（c）、pH值（d）對(duì)柚酒的脫苦率Fig.3 Removal rate of pomelo wine by enzymatic hydrolysis temperature (a), enzymatic hydrolysis time (b), amount of enzyme added (c) and pH value (d)

由圖3b可知，酶解時(shí)間在15~60 min范圍內(nèi)，柚皮苷脫除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在酶解時(shí)間為60 min時(shí)，柚皮苷脫除率達(dá)到最大值49.06%，隨后呈下降趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為75 min時(shí)，檸檬苦素脫除率達(dá)到最大值38.52%，僅比酶解時(shí)間為60 min時(shí)檸檬苦素脫除率高0.21%。延長(zhǎng)酶解時(shí)間，脫苦率降低，可能是在酶解時(shí)間增加的水浴過程中柚子酒中還未溶解的柚皮苷繼續(xù)溶解，使得測(cè)得的柚皮苷含量增加，從而導(dǎo)致脫苦率降低。因此，從節(jié)省能源，縮短生產(chǎn)周期考慮，選擇酶解時(shí)間為60 min。

由圖3c可知，在柚苷酶添加量0.5~2.0 g/L范圍內(nèi)，隨著酶添加量的增大而增大，當(dāng)酶添加量為2.0 g/L時(shí)，柚皮苷和檸檬苦素脫除率達(dá)到最大值，分別為51.98%、38.59%，隨后趨于平衡狀態(tài)，這與賀紅宇[20]檸檬汁脫苦試驗(yàn)結(jié)果柚皮苷脫除率 20.83%存在較大差距，但與梁澤建[21]試驗(yàn)結(jié)果50.30%又保持相近，可能是由于試驗(yàn)原材料不同而出現(xiàn)了分歧，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)過程中可發(fā)現(xiàn)，過多的酶蛋白不能完全溶于酒體中，對(duì)酒體品質(zhì)有一定程度的影響。因此，試驗(yàn)酶添加量選擇2.0 g/L為宜。

由圖3d可知，pH的變化對(duì)柚皮苷脫除率的影響較不明顯。pH在2.5~4.0范圍內(nèi)，檸檬苦素脫除率隨著pH的增大而增大，當(dāng)pH為4.0時(shí)，檸檬苦素含量從未經(jīng)任何處理的17.08 mg/L下降到10.38 mg/L、柚皮苷含量從165.69 mg/L下降到82.63 mg/L，脫除率達(dá)到最大值分別為39.26%、50.13%。柚皮苷脫除率與梁澤建的橙汁酶法脫除率50.30%相近，且都隨pH值的升高而降低，這是因?yàn)殍周彰傅淖钸m pH區(qū)間在3.5~5，pH為4.0時(shí)能最大發(fā)揮柚苷酶的活性，使之最大限度地作用于柚皮苷，增加酶與底物的反應(yīng)速度。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交助手軟件，通過L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，柚子酒脫苦工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3、表4所示。

表2 柚苷酶脫苦工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis of naringinase extraction process optimization

表4 以檸檬苦素脫除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results with the removal rate of limonin as the evaluation index

由表2可知，以柚皮苷脫除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)極差大小四個(gè)因素對(duì)柚子酒脫苦影響的大小順序?yàn)椋篊（酶添加量）＞A（酶解溫度）＞B（酶解時(shí)間）＞D（pH值），柚子酒中柚皮苷脫苦率的最佳工藝組合為A1B3C2D2。以檸檬苦素脫除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由極差大小四個(gè)因素對(duì)柚子酒脫苦效果的順序?yàn)椋篊（酶添加量）>B（酶解時(shí)間）>A（酶解溫度）>D（pH值），柚子酒中檸檬苦素脫除率的最佳工藝組合為A1B2C2D1。由表3、4可知，酶解溫度、酶解時(shí)間和酶添加量三個(gè)因素對(duì)柚子酒中柚皮苷和檸檬苦素脫苦率影響顯著（p<0.05）。考慮到節(jié)約經(jīng)濟(jì)，更好保證柚子果酒中原有的品質(zhì)和最大保留原酒中舒適苦澀的口感特點(diǎn)，本試驗(yàn)選擇對(duì)柚子酒進(jìn)行脫苦的最佳工藝條件為：酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間60 min，酶添加量2 g/L，pH值的大小影響不顯著，因此選擇pH值為4。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，三次重復(fù)試驗(yàn)得出柚子酒中檸檬苦素和柚皮苷脫除率平均值分別為 53.67%、42.19%，高于表2中的 9項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，與賀紅宇[20]對(duì)檸檬汁中柚皮苷苦脫除率達(dá)23.00%以上、畢靜瑩[15]對(duì)柑橘酒進(jìn)行瓊脂脫苦，檸檬苦素脫除率達(dá)到36.24%相比均顯示了較好的脫除效果。脫去了柚子酒中近一半的苦味，易于人體接受，故優(yōu)化后的脫苦工藝條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果A1B2C2D3。

表3 以柚皮苷脫除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results with the removal rate of naringin as the evaluation index

在賀紅宇[20]等研究柚皮苷酶法對(duì)檸檬汁脫苦實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果可見，比較各列的極差的值，可以發(fā)現(xiàn)，通過統(tǒng)計(jì)分析和顯著性測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，因素顯著，即在試驗(yàn)所設(shè)定的三個(gè)因素中，對(duì)檸檬汁脫苦率影響最大的因素是酶添加量，其次是酶解時(shí)間，酶解溫度對(duì)梓檬汁脫苦率的影響最小。得出實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平為柚皮苷酶用量 2 g/L、酶解溫度50 ℃、作用時(shí)間60 min。說明酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)柚皮苷酶法脫苦實(shí)驗(yàn)顯著性較為明顯。

已有研究表明，檸檬苦素在柑橘類果酒中陳釀兩年以上的還遠(yuǎn)高于閾值。除此，柚子酒中總黃酮（柚皮苷為代表）需要陳釀三年后含量才會(huì)逐漸降低降到閾值以下[22]，而此脫苦工藝可很大程度的縮短柚子酒陳釀周期，提高經(jīng)濟(jì)效益。

2.4 感官鑒定結(jié)果分析

柚子酒脫苦前后感官評(píng)分平面雷達(dá)圖分析結(jié)果見圖4。

由圖4可知，平面雷達(dá)圖能更直觀的呈現(xiàn)出柚子酒經(jīng)柚苷酶脫苦處理后與原酒品質(zhì)質(zhì)量的差異。脫苦處理后柚子酒中難以接受的苦味已得到很大程度的改善，苦澀味適宜，其聞香以清香感最為明顯，飲后有甜感，這使得柚子酒酒體更加醇和、果香濃郁、諸味協(xié)調(diào)。試驗(yàn)中并沒有將苦味除盡而是有所保留，既能讓檸檬苦素類似物具有的抗癌、抗HIV[23]，抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素[15]等高度活性物質(zhì)存在于酒體中，還能很好的保留柚子果酒本身輕微苦澀口感這一特征。與進(jìn)行脫苦處理的柚子酒相比，未進(jìn)行脫苦的柚子酒雖然保留了柚子酒原有的清香感，但他較強(qiáng)的苦澀味還是不易消費(fèi)者接受，總體感官評(píng)分低于酶法脫苦處理的柚子酒。

圖4 柚子酒脫苦前后感官評(píng)分雷達(dá)圖Fig.4 Radar map of sensory score before and after removing the bitterness of pomelo wine

2.5 酒體揮發(fā)性成分定性定量分析

根據(jù)前述方法對(duì)酒樣中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測(cè)定分析，圖5為柚子酒脫苦及未脫苦處理的GC-MS圖譜。

圖5 柚子酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds in pomelo wine

41 47.226 棕櫚酸乙酯 C18H36O2 0.340 0.568 42 47.854 順-9-十六碳烯酸乙酯 C18H34O2 - 0.023 43 50.891 琥珀酸單乙酯 C6H10O4 0.009 0.014 44 52.536 十八酸乙酯 C20H40O2 0.041 0.080 45 52.907 油酸乙酯 C20H38O2 0.025 0.055 46 53.906 亞油酸乙酯 C20H36O2 0.010 0.023 47 19.827 乙酸 C2H4O2 0.187 0.224 48 24.335 異丁酸 C4H8O2 0.005 0.007 49 28.122 2-甲基丁酸 C5H10O2 0.003 0.004 50 34.385 己酸 C6H12O2 0.011 0.018 51 41.408 辛酸 C8H16O2 0.092 0.139 52 47.834 正癸酸 C10H20O2 0.028 0.041 53 53.158 月桂酸 C12H24O2 0.002 0.003 54 57.198 肉豆蔻酸 C14H28O2 0.005 -55 62.002 棕櫚酸 C16H32O2 0.015 0.027 56 17.14 十四烷 C14H30 0.004 0.004 57 40.345 4-乙基-2-甲氧基苯酚 C9H12O2 0.052 0.072 58 44.96 4-乙基苯酚 C8H10O 0.011 0.014 59 40.345 4-乙基-2-甲氧基苯酚 C9H12O2 0.052 0.072 60 49.112 2,4-二叔丁基苯酚 C14H22O 0.004 0.007 61 42.446 柏木腦 C15H26O 0.001 0.002 62 11.295 苯乙烯 C8H8 0.297 0.002 63 1.642 乙醛 C2H4O 0.278 1.060 64 20.239 糠醛 C5H4O2 0.005 0.007 65 22.161 苯甲醛 C7H6O 0.002 0.003 66 32.723 3,5-二甲基苯甲醛 C9H10O 0.027 0.049 67 7.42 3-戊烯-2-酮 C5H8O 0.239 0.545 68 13.357 3-羥基-2-丁酮 C4H8O2 0.015 0.018 69 27.009 苯乙酮 C8H8O 0.004 0.005

從柚子酒脫苦及未脫苦處理中共檢測(cè)鑒定出 69種主要風(fēng)味化合物，其中主要包括醇類 16種、酯類30種、酸類9種、酚類4種、萜烯類2種、醛酮類7種、烷烴類1種。

根據(jù)檢出的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分含量作熱圖，可直觀地顯示脫苦處理與未脫苦處理的柚子酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量的差異及變化情況，來判定對(duì)柚子酒進(jìn)行脫苦處理的效果。由表5、圖6可知，柚子酒脫苦處理前后主要揮發(fā)性風(fēng)味成分種類基本沒有變化，其含量除了辛酸乙酯、苯乙烯有輕微降低，其余風(fēng)味成分含量均有小幅度的上升，這與Yadav, Mukesh[24]研究得出的柚苷酶除了具有去除苦味外，還可用于提高酒的香氣有著相同之處。這使得脫苦處理后的柚子酒有著更佳濃郁的果香及純正的口感，更加受人喜愛。

表5 柚子酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味成分檢出結(jié)果Table 5 Results of main volatile flavor components in pomelo wine

圖6 柚子酒脫苦前及脫苦后揮發(fā)性風(fēng)味化合物熱圖Fig.6 Heat map of volatile flavor compounds before and after the removal of bitterness from pomelo wine

由熱力圖可看出酯類是柚子酒中種類及含量最多的揮發(fā)性風(fēng)味成分，醇類次之。酯類是構(gòu)成花香和果香的主體，在各種酒品香氣組成中占有重要地位[25]，其生成途徑主要由微生物在釀造過程中經(jīng)?；o酶A和醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的共同作用下代謝而成以及在脂肪酶催化作用下由酸與醇反應(yīng)而生成[26]。經(jīng)脫苦處理后，酯類物質(zhì)含量均有上升，如青草香的乳酸乙酯、菠蘿香的辛酸乙酯、較為明顯的是具有水果香的乙酸乙酯由原來的54.984 μg/L增長(zhǎng)到70.578 μg/L等。這使得柚子酒酒體的果香與甜香更加濃郁，可作為酒體的特征香氣成分，這些物質(zhì)也均是清香型白酒的主體香氣特征成分[27]。對(duì)人體較好的物質(zhì)還有亞油酸乙酯，其含量也在增大，在人體內(nèi)可以水解產(chǎn)生人體必需脂肪酸—亞油酸，具有重要的活性功能[28]。除此，還生成了兩種新的物質(zhì)，具有榴蓮味的順-9-十六碳烯酸乙酯[29]和正己酸乙酯，其中正己酸乙酯不但具有蘋果的香氣，還具有抗肥胖作用[30]。

研究表明，酒體中醇類含量越高，則香氣和醇甜就越突出，醇類化合物主要通過酵母發(fā)酵代謝、蛋白質(zhì)分解等生成[31]。在醇類化合物中，除乙醇外，含量最高的是異戊醇，其次是2-甲基丁醇、異丁醇。其中，經(jīng)脫苦處理變化較大的是異戊醇由102.605 μg/L增長(zhǎng)到153.665 μg/L。除此，經(jīng)脫苦處理還還生成了新的物質(zhì)正丙醇，其是碳數(shù)大于3的高級(jí)醇，適宜濃度的高級(jí)醇可以賦予白酒特殊的香氣，使酒體豐滿柔和、圓潤(rùn)醇厚[27,32]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以柚子酒為研究對(duì)象，主要對(duì)其酒中的苦味物質(zhì)進(jìn)行柚苷酶脫苦處理，正交優(yōu)化最佳工藝為：酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間60 min、柚苷酶添加量2.0 g/L和 pH值為 4.0，柚皮苷含量從未經(jīng)任何處理的165.69 mg/L下降到76.76 mg/L、檸檬苦素含量從17.08 mg/L下降到 9.87 mg/L，脫除率達(dá)到最大值分別為53.67%、42.19%。揮發(fā)性香氣成分經(jīng)GC-MS技術(shù)定性，內(nèi)標(biāo)法定量進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行感官品評(píng)。結(jié)果顯示，柚子酒中共檢測(cè)鑒定出69種主要風(fēng)味化合物，其中主要包括醇類16種、酯類30種、酸類9種、酚類4種、萜烯類2種、醛酮類7種、烷烴類1種，對(duì)柚子酒進(jìn)行柚苷酶脫苦處理并沒有對(duì)酒體帶來不好的影響，反而生成了順-9-十六碳烯酸乙酯、正己酸乙酯和正丙醇這三種新的物質(zhì)，共同提升了酒體的香氣。試驗(yàn)結(jié)果表明，柚子酒經(jīng)柚苷酶脫苦處理方法可行，不僅改善了苦味，還提升了酒體的品質(zhì)，為消費(fèi)者提供了新的選擇。但本研究還存在一些不足，需要進(jìn)一步研究和解決：柚子酒發(fā)酵過程中，當(dāng)苦味物質(zhì)含量較低時(shí)未找到方法讓其保持較低狀態(tài)；發(fā)酵過程中檸檬苦素類似物的含量處于動(dòng)態(tài)平衡過程，其如何分解與轉(zhuǎn)化沒有進(jìn)行機(jī)理研究。這些可作為課題組后續(xù)研究的重點(diǎn)。