蔣曉玙，馬超，余凱，周安，朱國飛

（1.貴陽職業(yè)技術學院生化工程系，貴州貴陽 550081）（2.貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州貴陽 550003）

關鍵字：胡桃醌；脯氨酰順反異構酶1（Pin1）；光譜學；計算模擬；定點突變

胡桃楸和核桃在我國資源豐富，很多部分均可食用，具有很高的營養(yǎng)價值。大量研究結果表明，其含有的有效成分胡桃醌（Julgone，又名5-羥基-1,4-萘醌，屬于萘醌類化合物），不僅具有顯著的抗菌、止血功能，還具有較好的抗腫瘤功效，能有效地抑制胃癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，肺癌，結腸癌等惡性腫瘤的增殖[1-3]。然而，胡桃醌的這種抗腫瘤作用的分子機制任然還不是很清楚。

脯氨酰順反異構酶 1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）可以特異性調節(jié)磷酸化蛋白質中絲氨酸或蘇氨酸-脯氨酸模體（pSer/Thr-Pro）從順式構象轉為反式構象，從而調節(jié)該蛋白功能，影響一系列信號通路[4]。Pin1的底物蛋白在有絲分裂、轉錄、分化和DNA損傷應答等各種生物功能起著重要的作用。尤其值得注意的是，Pin1在原癌基因信號通路中也起著關鍵的作用，并且在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤細胞中過量表達，其表達量高低與腫瘤惡性程度成正相關，而抑制腫瘤細胞中 Pin1蛋白的活性能夠觸發(fā)細胞凋亡[5,6]。盡管研究表明，胡桃醌可作為 Pin1小分子抑制劑，能有效抑制其活性，從而抑制腫瘤增殖，但是胡桃醌與Pin1具體作用機制還知之甚少[7]。

為了從分子水平上探究胡桃醌對 Pin1的抑制機制，本研究采用最常用的光譜法結合計算模擬探究了胡桃醌與 Pin1的互作機理[8,9]。在本研究中，首先使用熒光光譜推斷出Pin1與胡桃醌的淬滅常數(shù)、結合常數(shù)、結合位點數(shù)以及熱力學參數(shù)等信息。其次，使用同步熒光光譜和圓二色譜探究胡桃醌對 Pin1構象的影響。再次，利用分子對接預測出潛在的結合位點，并對潛在的結合位點進行了定點突變，構建了H59A，L61A，C113A，S114和S154A等多個突變體，然后通過突變體熒光滴定對結合位點進行了驗證。最后，采用分子動力學模擬探究 Pin1與胡桃醌在體外隨時間變化的結合信息。申炳俊等探究了胡桃醌與人血清白蛋白的相互作用研究[3]，為從分子水平上了解胡桃醌在體內可能的運轉、代謝、排泄等提供了信息。本研究將從分子水平上探究胡桃醌與Pin1的相互作用，為闡明胡桃醌的抗腫瘤作用提供參考，為擴大胡桃醌的應用，綜合開發(fā)利用我國胡桃楸和核桃資源，研發(fā)具有防癌、抑癌、治癌功能的保健食品、藥品提供相應的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）和二甲基亞砜（DMSO）購買自Sigma公司；胡桃醌（Julgone）購買自源葉公司；胰蛋白胨和酵母提取物購買自OXOID公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素購買自生工公司；其他化學試劑均為國產分析純。

儀器：日立F-4700熒光光譜儀，Jasco J-815圓二色譜儀，戴爾T440塔式服務器。

1.2 實驗方法

1.2.1 Pin1及其突變體原核表達與純化

Pin1及其突變體H59A、L61A、C113A、S114和S154A重組質粒pET-19b由實驗室保存。首先將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，然后接種在含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，待其長到對數(shù)期時，18 ℃，加入IPTG誘導10 h。離心收集菌體，然后重懸菌體，超聲破碎，高速離心，棄沉淀，收集上清。將上清液倒入 Ni2+-NTA-Sepharose親和層析柱中，先用 20 mmol/L咪唑溶液洗脫雜蛋白，再用400 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白，最后使用超濾管去除咪唑溶液。

1.2.2 熒光光譜

在石英比色皿中，加入200 μL的5 μmol/L Pin1溶液，每次滴加適量的1 mmol/L胡桃醌溶液，測量熒光光譜，控制胡桃醌終濃度為 0、5、10、15、20和30 μmol/L。內源熒光光譜采用295 nm作為激發(fā)波長，掃描波長為 310~400 nm。同步熒光光譜測定使用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描范圍分別為270~310 nm和250~310 nm。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設置為5和10 nm，激發(fā)電壓為700 V，掃描速度為1200 r/mim。

1.2.3 圓二色譜

在比色皿中，加入200 μL的10 μmol/L Pin1溶液，每次滴定適量的1 mmol/L胡桃醌溶液，測量圓二色譜，控制胡桃醌終濃度為0、10和30 μmol/L。掃描速度設置為200 nm/min，響應時間設置為2 s，掃描波長為200~260 nm。

1.2.4 分子對接

Pin1的三維結構（PDB_ID：4TNS）下載自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫[10]。胡桃醌的三維結構（ZINC_ID：ZINC526257）下載自ZINC數(shù)據(jù)庫[11]。使用ADT工具對Pin1蛋白進行預處理，包括去除配體，去除結晶水，加氫，加電荷以及確定對接盒子。使用AutoDock Vina 1.0軟件進行分子對接[12]。

1.2.5 分子動力學模擬

使用GROMACS 4.6.5程序對分子對接之后的結合模型進行分子動力學模擬，使用 pdb2gmx和Ambertools程序分別獲取Pin1和胡桃醌參數(shù)文件[13]。Pin1與胡桃醌復合物的分子力場選用AMBER99SB，并進行20 ns分子動力學模擬。使用GROMACS 4.6.5自帶的工具進行模擬分析。

2 結果與討論

2.1 熒光發(fā)射光譜檢測胡桃醌與Pin1相互作用

熒光發(fā)射光譜能夠監(jiān)測蛋白結構中發(fā)色基團微環(huán)境的改變。Pin1蛋白包含三個色氨酸殘基和三個酪氨酸殘基，具有內源熒光現(xiàn)象。當激發(fā)波長為295 nm，主要呈現(xiàn)色氨酸殘基微環(huán)境變化。如圖1a所示，隨著胡桃醌濃度的增加，Pin1的內源熒光強度逐漸下降。表明胡桃醌結合到Pin1中，導致Pin1熒光淬滅。

熒光淬滅可以分為兩種，動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，可以根據(jù)Stern-Volmer方程計算淬滅常數(shù)（Ksv）和動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)（Kq）得出。公式如下所示：

式中，F(xiàn)為有胡桃醌時Pin1的熒光強度；F0為無胡桃醌時Pin1的熒光強度；τ0為胡桃醌不存在時熒光體的熒光壽命，約為10-8s[14]；[Q]為胡桃醌濃度。

根據(jù)公式 1，以F0/F對[Q]進行線性擬合，做出Stern-Volmer圖，根據(jù)擬合直線的斜率可以得出不同溫度下的Ksv和Kq值。如圖1b和表1所示，在293 K，胡桃醌對Pin1淬滅常熟（Ksv）為1.36×104L/mol，隨著溫度的增加，Ksv值逐漸降低，表明溫度升高會導致胡桃醌對Pin1的淬滅程度降低，這是一個典型的靜態(tài)淬滅特征。此外，在293 K和303 K條件下，Kq值分別為 1.36×1012L/(mol·s)和 0.66×1012L/(mol·s)，均遠大于最大擴散碰撞淬滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)[14]，進一步表明胡桃醌對 Pin1的熒光淬滅過程是靜態(tài)淬滅過程。

圖1 內源熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

對于靜態(tài)淬滅過程，可以使用 Lineweaver-Burk雙對數(shù)方程計算結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n），公式如下所示：

式中，F(xiàn)為有胡桃醌時Pin1的熒光強度；F0為無胡桃醌時Pin1的熒光強度；[Q]為胡桃醌濃度。

根據(jù)公式2，以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]進行線性擬合，做出 Lineweaver-Burk雙對數(shù)圖，以擬合直線的斜率和截距可以得出不同溫度下的n和Ka值。如圖1c和表1所示，在293 K條件下，Ka值為2.32×104L/mol，隨著溫度的增加，Ka值逐漸降低，表明溫度升高會導致胡桃醌對Pin1的結合程度降低，這也是靜態(tài)淬滅的典型特征之一。此外，在293 K和303 K條件下，n值分別為0.85和0.80，均接近1，表明胡桃醌對Pin1的結合只有一個結合位點。

表1 胡桃醌與Pin1相互作用熱力學參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters between juglone and Pin1

藥物與蛋白質之間的作用力主要有氫鍵，范德華力，疏水作用力和靜電作用力，它們可以通過 Van’t Hoff方程計算焓變（ΔH），熵變（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG）來判斷[15]。公式如下所示：

式中，Ka為公式2中計算的結合常數(shù)；T為實驗溫度；R為氣體常數(shù)。

根據(jù)公式3~5，可以分別計算出ΔH，ΔS和ΔG，結果如表1所示。在293 K和303 K條件下，ΔG分別為-24.49和-22.80 kJ/mol，表明胡桃醌與Pin1的結合是自發(fā)結合過程。根據(jù)Ross等歸納出來的熱力學規(guī)律[16,17]：當ΔH>0和ΔS>0時，作用力為疏水作用力；當ΔH<0和ΔS>0時，作用力為靜電作用力；當ΔH<0和ΔS<0時，作用力為氫鍵和范德華力。在293 K條件下，ΔH和 ΔS分別是 12.97 kJ/mol和 127.83 J/(mol·K)。這個結果表明胡桃醌與Pin1的結合過程中，主要的作用力是疏水作用力。此外，胡桃醌化學結構表明其有一個疏水性萘醌環(huán)組成，并含有一個羥基。因此，除了疏水作用力，氫鍵作用也不應該排除，詳細的作用力類型將在對接模型和MM/PBSA結合自由能中進一步討論。

2.2 同步熒光光譜檢測胡桃醌對 Pin1構象的影響

同步熒光光譜可以檢測蛋白質中色氨酸或酪氨酸微環(huán)境構象的變化。當Δλ（Δλ=λem–λex）分別等于15 nm和60 nm時，分別表示色氨酸和酪氨酸同步熒光光譜。如圖2a所示，當Δλ=15 nm時，隨著胡桃醌濃度的增大，酪氨酸熒光強度逐漸降低，表明胡桃醌可以淬滅酪氨酸內源熒光。并且，最大發(fā)射波長從 291 nm輕微紅移至293 nm，表明酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低，極性增加。如圖2b所示，當Δλ=60 nm時，隨著胡桃醌濃度的增大，色氨酸熒光強度逐漸降低，表明胡桃醌可以淬滅色氨酸內源熒光。與酪氨酸同步熒光類似，最大發(fā)射波長從281 nm輕微紅移至283 nm，表明色氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低，極性增加。

圖2 胡桃醌與Pin1相互作用同步熒光光譜。Fig.2 Synchronous fluorescence spectra between juglone and Pin1

2.3 圓二色譜檢測胡桃醌對 Pin1二級結構的影響

圓二色譜是最常見的檢測蛋白質二級結構變化的技術之一[18,19]。如圖3所示，Pin1的圓二色譜在208和222 nm附近有兩個負峰，是典型的α-螺旋結構。隨著胡桃醌濃度的增加，譜圖中負峰強度減弱，表明胡桃醌與Pin1結合會導致Pin1的α-螺旋結構減少?？赡苁呛阴c Pin1中α-螺旋結構中的氨基酸發(fā)生氫鍵締合等作用，引起Pin1空間變化，α-螺旋數(shù)量下降[20,21]。為了進一步定量α-螺旋含量的變化，使用如下兩個公式計算：

圖3 胡桃醌與Pin1相互作用圓二色譜Fig.3 Circular dichroism between juglone and Pin1

式中，Cp表示Pin1摩爾濃度（10 μM）；n表示Pin1氨基酸殘基數(shù)（163）；l表示樣品池的厚度（0.1 cm）；MRE208表示蛋白質在208 nm處的平均殘基橢圓率。

根據(jù)公式6和7，計算Pin1中α-螺旋含量。如圖3所示，當加入胡桃醌和Pin1的摩爾比分別為1:0、1:1和1:3時，對應的Pin1的α-螺旋含量為23.44%、20.11%和17.82%。表明胡桃醌會導致Pin1中的α-螺旋含量減少。同時譜圖形狀和峰尖位置沒有明顯變化，也進一步說明胡桃醌主要影響Pin1中的α-螺旋結構。

2.4 分子對接預測胡桃醌與Pin1的結合模型

分子對接是最常見預測藥物和蛋白結合的方法之一[22-24]。利用AutoDock Vina對胡桃醌和Pin1進行分子對接，預測兩者結合模型和作用機制。如圖4A所示，胡桃醌進入 Pin1疏水空腔中，并且與關鍵殘基His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154相互接觸。為了進一步分析胡桃醌與 Pin1中關鍵殘基作用力類型，詳細的結果展現(xiàn)在圖4B中，胡桃醌與Cys113、Ser114和Ser154形成三個氫鍵，以及與Cys113形成一個Pi-Alkyl鍵（一種疏水作用力），與His59和Leu61形成范德華力。這個結果與熱力學參數(shù)結論一致，表明胡桃醌與Pin1的作用力類型主要是疏水作用力，氫鍵和范德華力。

圖4 胡桃醌與Pin1相互作用預測結合模型Fig.4 Predicted binding model between juglone and Pin1

2.5 定點突變檢測胡桃醌與Pin1的結合殘基

為了進一步驗證胡桃醌與 Pin1相互作用的結合模型，采用定點突變技術將His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154突變?yōu)楸彼釟埢?。然后將胡桃醌滴加到Pin1野生型和突變體中，測量內源熒光光譜。如果突變體熒光滴定結果與Pin1野生型差異較大，表明該殘基是胡桃醌主要作用殘基，反之，則表明該殘基不是關鍵殘基。如圖5所示，突變體C113A與Pin1野生型和其它突變體結果差異較大，表明胡桃醌結合的關鍵殘基為Cys113。這個結果與之前文獻報道是一致的，進一步揭示胡桃醌結合Cys113殘基，導致Pin1酶活降低[7]。

圖5 胡桃醌對Pin1及其突變體熒光滴定結果Fig.5 Fluorescence titration between juglone and Pin1 and mutants

2.6 分子動力學模擬

分子動力學模擬可以模擬藥物與蛋白在生理狀態(tài)下，隨時間變化的結合情況[25]。均方根偏差（RMSD）可以反映藥物與蛋白結合穩(wěn)定性。如圖6a所示，Pin1-胡桃醌（Pin1-Julgone）體系和Pin1體系在20 ns模擬時間中，RMSD值變化幅度不大，表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結合到Pin1中。然而，C113A-胡桃醌（C113A-Julgone）體系在模擬時間內，RMSD值變化幅度明顯大于Pin1-胡桃醌和Pin1體系，表明Cys113殘基突變會影響胡桃醌對Pin1的結合。這個結果印證了突變體熒光滴定實驗，進一步表明胡桃醌結合的關鍵殘基是Cys113。均方根波動（RMSF）可以反映藥物與蛋白結合的柔韌性。如圖6c所示，Pin1-胡桃醌體系中的His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154的RMSF明顯低于Pin1體系，表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結合到這些關鍵殘基。

圖6 胡桃醌對Pin1的分子動力學模擬Fig.6 Molecular dynamics simulation between juglone and Pin1

蛋白質回旋半徑(Rg)能反映藥物與蛋白結合的緊湊程度。如圖6b，Pin1-胡桃醌體系的Rg值略微低于Pin1體系，表明胡桃醌結合到Pin1，促使其結構變得略緊湊。藥物與蛋白結合關鍵作用力之一是氫鍵，分析氫鍵的變化能揭示結合的穩(wěn)定性。如圖6d，Pin1-胡桃醌體系的氫鍵在模擬時間內一直存在，且平均值為2.51，非常接近對接模型的結果，表明氫鍵是胡桃醌與Pin1的作用力之一。

使用MM/PBSA方法，預測了Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系結合自由能。如表2所示，Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系的結合自由能（ΔGbind）分別為-62.93和-14.54 kJ/mol，表明Cys113殘基突變會顯著性減少結合自由能。此外，Pin1-胡桃醌體系中的范德華能（ΔEvdw），電勢能（ΔEele），極性溶劑能（ΔGpolar）和非極性溶劑能（ΔGnonpolar）分別為-78.36 kJ/mol，-1.05 kJ/mol，22.69 kJ/mol和-6.38 kJ/mol。表明胡桃醌結合到Pin1過程中，范德華力具有十分重要的作用。此外，Pin1-胡桃醌體系中的非極性自由能（ΔEvdw+ΔGnonpolar）和極性自由能（ΔEele+ΔGpolar）分別為-84.74和21.69 kJ/mol。表明胡桃醌結合到Pin1過程中，非極性自由能利于結合，而極性自由能不利于結合。

表2 MM/PBSA結合自由能分析(kJ/mol)Table 2 Analysis of binding energy using MM/PBSA method

3 結論

本文通過熒光光譜，圓二色譜，分子對接和分子動力學模擬等技術，研究胡桃醌與Pin1的相互作用。熒光光譜結果表明，胡桃醌對Pin1的熒光淬滅機制是典型的靜態(tài)淬滅，兩者形成Pin1-胡桃醌復合物。同步熒光光譜表明，胡桃醌結合到Pin1過程中淬滅了色氨酸和酪氨酸內源熒光，最大波長輕微紅移，導致其構象改變。此外，圓二色譜結果表明，胡桃醌結合到Pin1中，導致α-螺旋含量降低。熱力學參數(shù)，分子對接和分子動力學模擬結果表明，胡桃醌結合到 Pin1過程中，疏水作用力，氫鍵和范德華力是最要作用力。對接模型，突變體熒光滴定和分子動力學模擬結果揭示了胡桃醌主要作用于Cys113殘基。本研究提供了Pin1與胡桃醌相互作用的一些數(shù)據(jù)，有助于進一步了解胡桃醌對Pin1抑制機理，為綜合利用我國胡桃楸和核桃資源開發(fā)功能性食品、藥品提供一定的科學依據(jù)。