楊明琛，袁夢(mèng)欣，陸維，包怡紅,2，柴洋洋,2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040）

多糖是一種天然高分子多聚物，在自然界中廣泛存在，在生命體的各項(xiàng)生命活動(dòng)中承擔(dān)重要的職責(zé)，對(duì)生命體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起到非常重要的作用。對(duì)植物多糖的研究是目前的研究熱點(diǎn)。我國(guó)植物資源豐富，植物多糖是植物中除蛋白質(zhì)和核酸外的主要活性成分之一，具有多樣生物活性，且副作用小、來(lái)源廣泛[1]，對(duì)植物多糖的研究提供了有力的條件。有大量的研究結(jié)果表明植物多糖具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤等功能，特別是對(duì)植物多糖降血糖方面的研究，已經(jīng)取得較大的進(jìn)展。植物多糖在人體內(nèi)發(fā)揮多種生物活性作用，這些作用的發(fā)揮主要與其結(jié)構(gòu)以及消化、酵解和吸收過(guò)程有關(guān)[2]。許多植物多糖是在被人體消化酵解分解成小分子物質(zhì)后才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

黃精屬（Polygonatum）是藥食同源的百合科植物[3]，主要分布在北半球溫帶地區(qū)，如中國(guó)、印度、韓國(guó)、日本等，還有歐洲和北美洲的一些國(guó)家。黃精（Polygonatum sibiricum）在我國(guó)主要分布于黑龍江、遼寧、河北等地，資源豐富，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景，對(duì)黃精的研究也取得一定的進(jìn)展，已經(jīng)被應(yīng)用于功能食品以及保健品等的開(kāi)發(fā)中。目前黃精已有多種生物活性被報(bào)道，如抗氧化性和抗衰老性等。此外，現(xiàn)代藥理研究表明，黃精還具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫力等功能[4,5]。黃精有多種活性成分，包括多糖、甾體皂苷類(lèi)等，具有較高的食用價(jià)值。黃精多糖是黃精的主要活性成分之一，屬于雜多糖，其成分有半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖[6]，具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗病毒等功效[7]。

隨著對(duì)植物多糖的深入研究，關(guān)于植物多糖對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)功能的調(diào)節(jié)作用也被越來(lái)越多的學(xué)者注意到，并且植物多糖還會(huì)影響腸道穩(wěn)態(tài)和腸道微生物之間的相互作用，從而起到對(duì)人體健康的調(diào)節(jié)作用。由于植物多糖屬于大分子多聚物，人體無(wú)法直接消化吸收利用，腸道菌群能夠幫助宿主消化自身無(wú)法消化的物質(zhì)，將植物多糖分解為一系列具有生物活性的小分子物質(zhì)[8]。同時(shí)腸道菌群還對(duì)宿主細(xì)胞起到一定的調(diào)節(jié)、保護(hù)、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收等作用。此外，進(jìn)入腸道內(nèi)的多糖也會(huì)對(duì)腸道菌群的組成和生理狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響。因此宿主和腸道菌群之間是一種互利共生的關(guān)系[9]，目前我國(guó)糖尿病的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，特別是Ⅱ型糖尿病。研究人員發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)糖尿病的誘發(fā)和控制有一定的作用。通過(guò)調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)，不僅對(duì)糖尿病有一定的治療作用，甚至能夠起到一定的預(yù)防作用[10]。

本文主要研究黃精多糖的消化特性及其對(duì)Ⅱ型糖尿病鼠腸道菌群的影響。通過(guò)黃精多糖體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，研究黃精多糖的消化特性；進(jìn)一步采用Ⅱ型糖尿病鼠糞便，建立黃精多糖體外酵解模型，并對(duì)酵解產(chǎn)物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，探究黃精多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

黃精購(gòu)自哈爾濱藥材市場(chǎng)，Ⅱ型糖尿病小鼠購(gòu)自青島大任富城畜牧有限公司（許可證號(hào)：SCXK (Lu)2014-0007）。

1.1.2 試劑

瓜爾豆膠，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；膽酸鈉、粘蛋白、α-淀粉酶、果膠、刃天青、L-半胱氨酸購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；一水合硫酸鎂購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿拉伯半乳聚糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

高速多功能粉碎機(jī)：上海市頂帥工貿(mào)有限公司；電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；真空旋蒸儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；IS-RSD3臺(tái)式恒溫振蕩器：美國(guó)精騏有限公司；電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃精多糖提取與含量測(cè)定

1.2.1.1 黃精多糖提取

將黃精粉末按照液料比15:1加入蒸餾水，使用超聲波清洗儀在60 ℃下浸提90 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液在55 ℃下旋蒸得濃縮液，加入3倍體積75%乙醇醇沉12 h后離心，取沉淀冷凍干燥得到黃精多糖粗提物（PSP），用Sevage法除蛋白，冷凍干燥得到PSP1。計(jì)算得率，取三個(gè)平行的均值。公式如下：

式中：W1為樣品中的PSP1的得率，%；M為樣品的質(zhì)量，g；M1為樣品中的PSP1的質(zhì)量，g。

1.2.1.2 含量測(cè)定

取PSP1樣品進(jìn)行含量的測(cè)定，配置10 mg/mL的樣品溶液?？偺呛渴褂帽椒恿蛩岱╗11]測(cè)定，還原糖含量使用 DNS法[12]測(cè)定，蛋白質(zhì)含量使用考馬斯亮藍(lán)法[13]測(cè)定。計(jì)算PSP1的多糖含量，計(jì)算公式如下：

式中：W2為樣品中黃精多糖含量，%；W3為樣品溶液中可溶性總糖含量，%；W4為樣品溶液中還原糖含量，%。

1.2.2 體外消化模擬

1.2.2.1 口腔消化模擬

口腔電解質(zhì)的配置參考文獻(xiàn)[5]稍作修改：NaCl 0.7644 g、KCl 1.491 g、CaCl20.1332 g溶于1 L的蒸餾水中，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaHCO3將pH調(diào)至6.9（±0.05）。

取6支試管，分成3組，每支試管都加入10 mg/mL PSP1溶液5 mL與口腔電解質(zhì)5 mL，α-淀粉酶0.05 g，37 ℃消化2 min，每組取一支試管沸水浴2 min滅酶活，儲(chǔ)存待測(cè)，剩下的口腔消化液做進(jìn)一步消化。

1.2.2.2 胃部消化模擬

胃液的配置參考文獻(xiàn)[5]稍作修改：KCl 2.2 g，NaCl 6.2 g，CaCl20.3 g，NaHCO31.2 g溶于2 L蒸餾水中，用1 mol/L HCl將pH調(diào)至2。

取胃液100 mL，加入胃蛋白酶0.03 g，最終酶活達(dá)到 500 U/mL。加入經(jīng)過(guò)口腔消化后的消化液 10 mL，在37 ℃下恒溫振蕩2 h，分別在15、30、60、90、120 min時(shí)取消化液2 mL，沸水浴2 min滅酶活，儲(chǔ)存待測(cè)，剩下的胃部消化液做進(jìn)一步消化。

1.2.2.3 腸道消化模擬

腸液的配置參考文獻(xiàn)[5,14]：KCl 0.65 g，NaCl 5.4 g，CaCl20.33 g溶于1 L蒸餾水中，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7。膽汁：4%膽酸鹽溶液。

模擬腸道消化：取腸電解質(zhì)100 mL加入胰酶0.04 g，使最終酶活達(dá)到100 U/mL，加入膽汁12.5 mL，加入經(jīng)過(guò)口腔和胃部消化的多糖溶液10 mL，在37 ℃下恒溫振蕩2 h，分別在15、30、60、90、120 min時(shí)取消化液2 mL，沸水浴2 min滅酶活，儲(chǔ)存待測(cè)。

1.2.2.4 含量測(cè)定

取各階段的消化液樣品，采用 DNS法測(cè)定還原糖含量。方法同1.2.1.2。根據(jù)OD值和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算還原糖含量。

1.2.2.5 分子量測(cè)定

使用凝膠色譜法測(cè)定消化液中多糖分子量[15,16]。取黃精多糖的消化液，用0.22 μm水系膜過(guò)濾后的濾液進(jìn)行色譜分析。色譜分離條件如下：色譜柱：PL aquagel-OH 30（7.5×300 mm，8 μm）和PL aquagel-OH 30（7.5×300 mm，8 μm）凝膠柱串聯(lián)使用；檢測(cè)器：Agilent 1260示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：水；柱溫：30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。

1.2.3 體外酵解實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 配制發(fā)酵培養(yǎng)基

酵解培養(yǎng)基的配制[17]：氯化鈉4.5 g，氯化鉀4.5 g，果膠2.0 g，粘蛋白4.0 g，一水合硫酸鎂0.69 g，瓜爾膠1.0 g，L-半胱氨酸0.8 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，酪蛋白3.0 g，阿拉伯半乳聚糖2.0 g，碳酸氫鈉1.5 g，膽酸鹽0.4 g，七水合硫酸亞鐵0.005 g，氯化鈣0.08 g，1 mL Tween 80和4 mL（0.025%，W/V）刃天青（厭氧指示劑），用蒸餾水定容于1.0 L容量瓶中，在121 ℃條件下滅菌30 min，備用。

1.2.3.2 體外發(fā)酵

通過(guò)高脂飲食-鏈脲霉素誘導(dǎo)[18]的方法建立Ⅱ型糖尿病鼠模型，采用應(yīng)激性排便法，將小鼠尾部提起，輕輕按壓其下腹部，收集小鼠新鮮糞便于無(wú)菌EP管中。取Tween 0.5 mL，酵母2 g，蒸餾水定容至500 mL配制成溶液。將小鼠的新鮮糞便加入到溶液中，配置成20%（W/W）的固液混合物，渦旋混勻，隨后立即轉(zhuǎn)入到厭氧操作臺(tái)中，用兩層濾布過(guò)濾，收集濾液，備用。

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法稍作改進(jìn)：以無(wú)菌蒸餾水作為對(duì)照組（CG），黃精多糖作為實(shí)驗(yàn)組（PG），最終酵解培養(yǎng)體系的體積組成為小鼠糞便液：發(fā)酵培養(yǎng)液：多糖=4:4:2，將樣品發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到厭氧袋中密封，放入37 ℃培養(yǎng)箱，48 h后取出，打開(kāi)厭氧袋并迅速冰水浴10 min，終止多糖的酵解反應(yīng)。將樣品發(fā)酵液4000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行16S rDNA分析。

1.2.3.3 腸道菌群分析

使用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit腸道內(nèi)容物DNA提取試劑盒提取酵解液中腸道菌群DNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)引物341F（5'-CCTACGGG NGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3'）的擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增和上機(jī)測(cè)序分析工作委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。Fqtrim（v0.94）軟件將原始序列進(jìn)行過(guò)濾，并獲得高質(zhì)量的讀段。為了分析微生物群落組成的多樣性，使用Vsearch軟件（v2.3.4）對(duì)最終序列進(jìn)行聚類(lèi)以獲得操作分類(lèi)單位（OTU），并在不同物種分類(lèi)級(jí)別對(duì)OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。利用QIIME2軟件統(tǒng)計(jì)微生物群落的α多樣性和β多樣性，它們包含的指標(biāo)可以反映微生物群的多樣性。SILVA（Release 132）和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)用于物種分類(lèi)和隨后的物種組成分析以確保注釋結(jié)果完整準(zhǔn)確。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù) 3次，數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。采用SPSS 22.0和Excel 2016軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析采用t檢驗(yàn)，p<0.05表示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃精多糖提取與含量測(cè)定

黃精多糖經(jīng)超聲輔助熱水浸提，乙醇沉淀獲得PSP，對(duì)黃精多糖進(jìn)行脫蛋白處理后，得到黃精多糖樣品 PSP1，得率為 19.93%。經(jīng)測(cè)定總糖含量為84.04%，還原糖含量為0.95%，蛋白質(zhì)含量為0.71%，多糖含量為83.09%。

2.2 黃精多糖的體外消化模擬

在消化過(guò)程中，導(dǎo)致多糖相對(duì)分子量發(fā)生變化的因素主要是多糖的解聚作用和糖苷鍵的斷裂[19,20]。本研究對(duì)黃精多糖進(jìn)行體外消化模擬，探究黃精多糖的消化特性。如圖和表所示，在各個(gè)消化階段，PSP1的相對(duì)分子質(zhì)量基本不變。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，PSP1相對(duì)分子質(zhì)量逐漸降低，還原糖含量逐漸升高。在經(jīng)過(guò)胃部模擬消化2 h后，PSP1相對(duì)分子量由24.19 ku降低為20.39 ku，還原糖含量從0.17 mg/mL增加至0.20 mg/mL。差異具有顯著性（p<0.05）。在小腸模擬消化2 h后，PSP1相對(duì)分子量由28.85 ku降低為24.35 ku，還原糖含量從0.17 mg/mL增加至0.19 mg/mL。差異具有顯著性（p<0.05）。在陳春等[21]的研究中，桑葚多糖在胃部消化模擬過(guò)程中，相對(duì)分子量顯著下降，還原糖含量上升，可能是由于胃部酸性環(huán)境造成，但是在腸道消化階段相對(duì)分子量未發(fā)生顯著變化，可能是由于多糖糖苷鍵種類(lèi)、分子量、多糖的組成等因素不同導(dǎo)致。黃精多糖經(jīng)過(guò)胃腸消化模擬，相對(duì)分子質(zhì)量有一定程度的下降，同時(shí)還原糖含量有相應(yīng)程度的上升，說(shuō)明在腸胃消化過(guò)程中相對(duì)分子質(zhì)量的降低主要是由于糖苷鍵的斷裂引起。黃精多糖在消化過(guò)程中會(huì)發(fā)生一定程度的降解，可能是受到胃部酸性環(huán)境以及消化道中消化酶的影響，導(dǎo)致黃精多糖發(fā)生多糖的解聚作用，部分糖苷鍵斷裂，還原糖含量上升。但是從PSP1相對(duì)分子質(zhì)量的變化趨勢(shì)可以得出，雖然黃精多糖會(huì)在消化過(guò)程中發(fā)生一定的降解作用，但是大部分的黃精多糖能夠達(dá)到大腸末端，被腸道菌群利用。

圖1 黃精多糖體外模擬口腔（a）、胃部（b）和小腸（c）消化不同時(shí)間點(diǎn)的HPGPC色譜圖Fig.1 HPGPC chromatograms of polysaccharide after simulated mouth (a), gastric (b) and small intestinal (c)digestion

表1 口腔、胃和小腸消化不同時(shí)間點(diǎn)的黃精多糖的相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)和還原糖含量的變化(CR)Table 1 Molecular weight distribution and content of reducing sugars (CR) of polysaccharide at different time points in gastric and small intestinal digestion

2.3 腸道菌群多樣性和物種組成分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指的是腸道菌群的多樣性，能夠綜合反映腸道菌群的物種豐富度和均勻度。其中物種豐富度指的是腸道菌群的物種多樣性，均勻度指的是物種組成多少的整體分布。本研究通過(guò)稀釋曲線和物種相對(duì)豐度曲線綜合評(píng)估酵解產(chǎn)物的Alpha多樣性[22]。

稀釋曲線是指從一個(gè)樣測(cè)序得到的所有序列進(jìn)行隨機(jī)數(shù)目的抽取，并且統(tǒng)計(jì)隨機(jī)抽取得到序列的OTU數(shù)目，以抽取序列數(shù)目為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的 OTU數(shù)目為縱坐標(biāo)，繪制曲線。稀釋曲線能夠統(tǒng)計(jì)feature的豐富度，通過(guò)不同樣品的稀釋曲線能夠直接觀察物種多樣性的差異，此外稀釋曲線還能夠直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量趨于合理。如圖2所示，小鼠腸道菌群稀釋曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量足夠大，更多的數(shù)據(jù)只會(huì)增加少量的新的OTU，測(cè)序結(jié)果具有一定的合理性，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。在測(cè)序深度相同的情況下，PG組的豐富度顯著高于CG組，說(shuō)明黃精多糖對(duì)小鼠的腸道菌群能夠起到一定的調(diào)節(jié)作用，提高腸道菌群的豐富度。

圖2 基于OUT總數(shù)的腸道菌群稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of intestinal flora based on total OUT

物種相對(duì)豐度曲線也常用于分析樣本中腸道菌群的物種多樣性，主要通過(guò)物種豐富度和物種均勻度兩項(xiàng)指標(biāo)綜合反映物種的多樣性。其中物種相對(duì)豐度曲線的寬度反映樣品的豐富度，形狀反映樣本中物種的均勻度。如圖3所示，6個(gè)樣品的曲線趨勢(shì)在總體上較為相似。在水平方向上，PG組的豐富度顯著高于CG組。從樣品曲線的形狀進(jìn)行分析，圖中各個(gè)樣品曲線的平滑程度較好，在末端有部分曲折，整體趨勢(shì)平緩，說(shuō)明兩組樣品的物種分布均勻[23]。

圖3 小鼠腸道菌群物種相對(duì)豐度曲線Fig.3 Relative species richness curve of mice intestinal flora

2.3.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要用于分析不同樣本之間的物種組成結(jié)構(gòu)差異性?；跇悠返膄eature分析結(jié)果，綜合unweighted unifrac和weighted unifrac兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，衡量?jī)蓚€(gè)樣本組之間的差異性。圖中不同顏色代表不同分組，聚類(lèi)樹(shù)主要顯示樣本之間的相似度，樣本間的分支越短，說(shuō)明兩個(gè)樣本的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。UPGMA聚類(lèi)分析能夠直觀地表達(dá)不同樣本之間的物種組成結(jié)構(gòu)差異程度，如圖4所示，比較PG組和CG組的分支，結(jié)果顯示兩個(gè)樣本組分別有各自聚集的趨勢(shì)，說(shuō)明兩個(gè)樣本組的組內(nèi)差異性顯著低于組間差異性，既兩個(gè)樣本組的物種組成結(jié)構(gòu)差異顯著，說(shuō)明黃精多糖對(duì)酵解產(chǎn)物中腸道菌群的物種組成結(jié)構(gòu)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖4 小鼠腸道菌群UOGMA聚類(lèi)分析Fig.4 Clustering analysis of mice intestinal flora UOGMA

2.3.3 在門(mén)水平上的菌群豐度及差異

為了進(jìn)一步分析黃精多糖對(duì)腸道菌群的影響，通過(guò)對(duì)小鼠糞便中微生物進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，將微生物由門(mén)到種進(jìn)行各個(gè)水平上的分類(lèi)，繪制腸道菌群門(mén)（Phylum）水平物種組成柱狀圖。如圖5所示，腸道菌群在門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要有厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）等[24]。其中 PG 組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）占57.44%，變形菌門(mén)（Proteobacteria）占30.79%，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占10.55%。而CG組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）占84.27%，變形菌門(mén)（Proteobacteria）占8.81%，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占6.26%。經(jīng)過(guò)黃精多糖的干預(yù)后，腸道菌群的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度下降 26.83%，變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度分別提高21.98%、4.29%。門(mén)水平中，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)是最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比90%以上。研究表明，糖尿病患者在高血糖的同時(shí)往往伴隨菌群失調(diào)。與正常人相比，糖尿病患者腸道菌群中的厚壁菌門(mén)的豐度顯著上升，而擬桿菌門(mén)的豐度顯著降低，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例也顯著升高[25]。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)對(duì)宿主能量的吸收和代謝有協(xié)同作用，腸道菌群經(jīng)過(guò)黃精多糖的酵解之后，菌群結(jié)構(gòu)往正常人的方向發(fā)展。說(shuō)明黃精多糖對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成有明顯的調(diào)節(jié)作用，并且這種調(diào)節(jié)作用對(duì)人體是有益的。姜雅杰等[26]的研究表明，正常小鼠和Ⅱ型糖尿病小鼠的腸道菌群對(duì)比，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著升高，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低。和本研究結(jié)果一致，說(shuō)明黃精多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的腸道菌群有顯著的改善調(diào)節(jié)作用。

圖5 小鼠腸道菌群門(mén)水平物種組成柱狀圖Fig.5 Phyla species composition of mice intestinal flora at phylum level

2.3.4 在屬水平上的菌群豐度及差異

如圖6所示，腸道菌群從屬（Genus）分類(lèi)水平上比較，優(yōu)勢(shì)菌屬有乳酸菌屬（Lactobacillus）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等。其中，PG組中乳酸菌屬（Lactobacillus）占34.02%、韋榮氏球菌屬（Veillonella）占 20.88%、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）占 15.75%、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）占14.11%、擬桿菌屬（Bacteroides）占2.95%、普雷沃菌屬（Prevotella_9）占 2.63%、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides）占2.52%。而CG組中，乳酸菌屬（Lactobacillus）占 77.69%、韋榮氏球菌屬（Veillonella）占 2.33%、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）占 3.94%、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）占 4.49%、擬桿菌屬（Bacteroides）占1.40%、普雷沃菌屬（Prevotella_9）占 0.34%、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides）占0.41%。PG組和CG組對(duì)比，乳酸菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度降低43.67%，韋榮氏球菌屬（Veillonella）、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）相對(duì)豐度分別提高18.55%、11.81%、9.62%。此外，擬桿菌門(mén)的擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃菌屬（Prevotella_9）、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides）分別升高1.55%、2.29%、2.11%。研究表明[27]普雷沃菌屬能夠產(chǎn)生乙酸和琥珀酸及少量的異丁酸、異戊酸等代謝產(chǎn)物，體內(nèi)普雷沃菌的豐度提高能減少機(jī)體過(guò)敏以及肥胖的發(fā)生率。劉雙江等[28]的研究表明狄氏副擬桿菌能通過(guò)產(chǎn)生琥珀酸和次級(jí)膽汁酸減輕肥胖和代謝功能障礙。以上表明黃精多糖對(duì)糖尿病鼠的腸道菌群有顯著的調(diào)節(jié)作用。周建波等[29]對(duì)于黃精生物活性的研究發(fā)現(xiàn)，口服黃精多糖能夠改善腸道菌群，起到預(yù)防糖尿病的作用。

圖6 小鼠腸道菌群屬水平物種組成柱狀圖Fig.6 Phyla species composition of mice intestinal flora at genus level

3 結(jié)論

3.1 本文對(duì)黃精多糖的消化特性進(jìn)行探究，通過(guò)體外消化模擬和體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)探究黃精多糖的消化規(guī)律及其對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群的影響。首先提取黃精多糖，得率為19.93%，總糖含量為84.04%，還原糖含量為 0.95%，蛋白質(zhì)含量為 0.71%，多糖含量為83.09%。

3.2 對(duì)黃精多糖進(jìn)行體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，在胃部消化模擬階段，PSP1相對(duì)分子量由24.19 ku降低為20.39 ku，還原糖含量從0.17 mg/mL增加至0.19 mg/mL；在腸道模擬消化階段，PSP1相對(duì)分子量由 28.85 ku降低為24.35 ku，還原糖含量從0.17 mg/mL增加至0.19 mg/mL。差異具有顯著性（p<0.05）。

3.3 在黃精多糖的體外酵解模擬實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)酵解物進(jìn)行16S rDNA分析，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病小鼠的腸道菌群經(jīng)過(guò)黃精多糖的酵解后，其腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生顯著變化。從菌門(mén)水平上比較，其厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著上升。從菌屬水平上比較，乳酸菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，韋榮氏球菌屬、埃希氏菌屬和克雷伯氏菌屬的相對(duì)豐度顯著上升，兩組菌屬結(jié)構(gòu)差異顯著。

3.4 研究表明，黃精多糖是天然大分子多聚物，在消化過(guò)程中無(wú)法被完全消化吸收，主要通過(guò)被腸道末端的腸道菌群分解成小分子進(jìn)而被吸收利用，同時(shí)黃精多糖還對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)起到一定調(diào)節(jié)作用。