張?jiān)陆?張新永 李艷嬌 邢江艷 林 奇 包媛媛

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650000)

美藤果(Sacha Inchi)又名印加果、南美油藤、星油果等，是一種大戟科木質(zhì)藤本植物[1，2]。美藤果原產(chǎn)中美洲、南美洲和東南亞等地區(qū)[3]，目前已大面積引種云南西雙版納、紅河等地區(qū)[4]。2013年美藤果油被衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)為新資源食品[5]，其是以美藤果種籽為原料, 經(jīng)脫殼、粉碎、壓榨、過濾等工藝制成的淡黃色透明油狀液體。Páucar等[6]采用酸敗法對美藤果油貨架期評價(jià)，在20 ℃時美藤果油貨架期可達(dá)到3.29年。薛莉等[7]報(bào)道美藤果油中甾醇含量高于其他常見植物油，讓美藤果油具有較強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。

以核桃為原料加工的天然核桃油脂，在市場上備受消費(fèi)者青睞[8]，然而目前核桃油加工產(chǎn)業(yè)核心是核桃油穩(wěn)定性問題[9，10]。為解決核桃油氧化問題，添加抗氧化劑，然而常用抗氧化劑TBHQ會對動物有致突變，BHA和BHT有致癌[11]。核桃油中甾醇含量為β-谷甾醇(75.10±19.26) mg/100 g；豆甾醇(17.49±9.34) mg/100 g[12]。有報(bào)道甾醇是植物油本身天然抗氧化成分[13]，能有效延緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制油脂酸值和過氧化值升高[14]，高瑀瓏等[15]發(fā)現(xiàn)甾醇在大豆油中具有抗氧化作用且存在顯著的量效關(guān)系；黃瀅璋等[14]結(jié)果顯示甾醇抗氧化作用明顯優(yōu)于 BHT 和 VC。李昌璞等[16]研究發(fā)現(xiàn)玉米油中甾醇濃度與羥自由基清除作用強(qiáng)度有明顯量效關(guān)系。

本研究測定美藤果油中甾醇，初步探明美藤果油和核桃油甾醇不同，按美藤果油甾醇比例添加甾醇于核桃油中，以添加維生素E、檸檬酸、BHA、TBHQ的核桃油為對照組，采用 Schaal 烘箱法，研究美藤果油甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性的影響，確定油脂中甾醇抗氧化作用以及其與天然抗氧化劑(維生素E、檸檬酸)協(xié)同增效作用，為研究天然復(fù)配抗氧化劑以及核桃油等油脂保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美藤果仁：云南普洱；核桃：大理漾濞；豆甾醇和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)；甲醇、叔丁基甲醚：色譜純；TBHQ、維生素E、BHA、檸檬酸均為食品添加劑。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoUltimate3 000高效液相色譜儀，RG-306游俠榨油機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 美藤果油制備

美藤果果仁脫殼備用。準(zhǔn)確取備用美藤果果仁5 kg，采用螺旋冷榨機(jī)壓榨，離心過濾(3 500 r/min,10 min)處理美藤果毛油釋出沉淀物，收集離心后的油液澄清無雜質(zhì)呈淡黃色。

1.3.2 美藤果油中甾醇提取

參照高政等[17]、趙茜茜等[18]的方法。稱混勻的美藤果毛油10 g(精確至0.01 g)，加入1 mol/L的氫氧化鈉-乙醇溶液，加入適量沸石；水浴鍋溫度為85 ℃，冷凝回流煮沸1 h，用燒杯取適量蒸餾水，取幾滴皂化液滴入蒸餾水中，看滴入的皂化液是否完全溶解沒有油質(zhì)，若完全溶解則說明皂化完全。皂化完全后減壓蒸餾回收乙醇；加蒸餾水稀釋，取出沸石，冷卻皂化液備用。將乙醚加入皂化液，置于分液漏斗充分接觸，靜置分層，多次萃取，合并上層乙醚萃取液，依次用蒸餾水、氫氧化鈉水溶液、蒸餾水洗滌，最后至乙醚溶液呈中性；再將乙醚溶液用無水硫酸鈉多次過濾，減壓蒸餾回收揮干乙醚，即得到美藤果油甾醇粉末粗提物。

1.3.3 美藤果油中甾醇的測定1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為Syncronis-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相∶甲醇；波長∶205 nm；柱溫∶30 ℃；進(jìn)樣量∶10 μL；流速: 1 mL/min。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品豆甾醇、β-谷甾醇10 mg置于燒杯中，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解定容于5 mL容量瓶，即得濃度分別為2 mg/mL的豆甾醇和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，混合得到濃度分別為1 mg/mL豆甾醇和β-谷甾醇，即混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)稀釋，豆甾醇和β-谷甾醇濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL混合線性標(biāo)準(zhǔn)品，搖勻溶液過0.22 μm微孔濾膜，置于樣品瓶，以濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.4 樣品溶液配制

取10 g美藤果油經(jīng)1.3.2提取得到甾醇粗提物0.10 g(精確至0.01 g)，置于10 mL的燒杯中，加入叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解，定容于10 mL容量瓶，搖勻溶液過0.22 μm微孔濾膜，置于樣品瓶。

1.3.3.5 樣品含量測定

將1.3.3.4樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣，通過混合甾醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行美藤果油甾醇定性，計(jì)算其峰面積平均值，用外標(biāo)法計(jì)算美藤果油甾醇含量。

1.3.4 甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性的影響

核桃油預(yù)處理：同前1.3.1步驟處理得到澄清現(xiàn)榨核桃油；將甾醇標(biāo)準(zhǔn)品按β-谷甾醇和豆甾醇比例為2∶1混勻備用。

參考田雨等[19]的方法。采用Schaal烘箱法,添加甾醇、用維生素E、TBHQ、BHA、檸檬酸作為對照，根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，添加量分別設(shè)置為100、150、200 mg/kg的核桃油樣；同時不添加核桃油作為空白。將所有核桃油樣于25 ℃超聲處理10 min溶解混勻，放置溫度為(60±1) ℃的恒溫干燥箱，加快氧化，每隔12 h充分振蕩混勻，并交換油樣位置，每48 h測定核桃油的過氧化值和酸值。酸值按GB 5009.229—2016中指示劑滴定法；過氧化值按GB 5009.227—2016中滴定法。

1.3.5 復(fù)配甾醇抗氧化劑對核桃油抗氧化效果

將甾醇、維生素E和檸檬酸復(fù)配作為天然抗氧化劑添加到核桃油中，以過氧化值為響應(yīng)值，采用BOX-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，將甾醇、維生素E、檸檬酸添加量設(shè)為200 mg/kg。按方案添加核桃油樣，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1) ℃加速氧化10 d，測定所有核桃油樣的過氧化值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為至少3次測定的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差；相關(guān)性分析采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)處理軟件，差異顯著(P<0.05)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 美藤果油中甾醇含量研究結(jié)果

2.1.1 美藤果油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

根據(jù)圖1叔丁基甲醇(1∶4)溶液HPLC色譜圖與圖2混合甾醇標(biāo)品(1 mg/mL豆甾醇和1 mg/mLβ-谷甾醇)HPLC色譜圖，結(jié)果顯示，空白叔丁基甲醇溶液與混合甾醇標(biāo)品，在同一保留時間無色譜峰，說明空白叔丁基甲醇(1∶4)溶液對美藤果油甾醇的含量測定無干擾。

圖1 叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液的HPLC色譜圖

混合甾醇標(biāo)品色譜圖(圖2)分析得知，豆甾醇標(biāo)品出峰時間約在24 min左右，β-谷甾醇標(biāo)品出峰時間約在28 min左右，分離較完整且峰形較好。根據(jù)豆甾醇和β-谷甾醇標(biāo)品峰面積分別與濃度的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出在0.1～1 mg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程：豆甾醇Y=97.809x-0.807 1，R2為0.999；β-谷甾醇Y=69.442x-0.111 2，R2為0.999。

圖2 混合甾醇標(biāo)品為1 mg/mL豆甾醇和1 mg/ml谷甾醇的HPLC色譜圖

2.1.2 精密度結(jié)果

混合甾醇標(biāo)準(zhǔn)品樣品(豆甾醇和β-谷甾醇質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL)經(jīng)HPLC測定，得到峰面積結(jié)果(表2)，計(jì)算得知豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品RSD為0.28%，β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品RSD為0.70%，說明儀器精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 加標(biāo)回收率結(jié)果

美藤果油甾醇加標(biāo)樣品經(jīng)HPLC測定，得到峰面積結(jié)果(表3、表4)，計(jì)算得知豆甾醇平均回收率為102.1%，RSD為0.71%；β-谷甾醇平均回收率為103.9%，RSD為0.56%；說明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 美藤果油樣豆甾醇加標(biāo)回收率結(jié)果

表4 美藤果油樣谷甾醇加標(biāo)回收率

2.1.4 美藤果油甾醇含量的確定

美藤果油甾醇粗提物樣品HPLC色譜圖(圖3)，可知β-谷甾醇和豆甾醇是美藤果油甾醇的主要成分。美藤果油甾醇粗提物樣品的豆甾醇出峰時間約在24.5 min左右；β-谷甾醇出峰時間約在28.2 min左右；與甾醇混合標(biāo)品相比，出峰時間較相近，峰形變化不大，只是峰面積有所變化；計(jì)算美藤果油甾醇粗提物樣品溶液的峰面積，其中豆甾醇峰面積為(66.430 1±0.45) mAU·min，β-谷甾醇峰面積為(108.542 5±0.32) mAU·min，得美藤果油中豆甾醇含量為(68.743 4±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量為(156.466 8±0.46) mg/100 g。

圖3 美藤果油甾醇粗提取物為0.1 g/10 mL樣品的HPLC色譜圖

2.2 甾醇對核桃油氧化穩(wěn)定性影響結(jié)果

2.2.1 過氧化值的分析

隨貯藏時間增加，核桃油樣氧化酸敗加大，核桃油樣品過氧化值的量為1 kg核桃油樣品中活性氧的毫摩爾數(shù)，過氧化值增大，說明核桃油被氧化程度加深。

2.2.1.1 不同添加量甾醇對核桃油過氧化值結(jié)果

由表5可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1)℃加速氧化12 d后，相當(dāng)于常溫20 ℃保存192 d,其中未添加甾醇的空白核桃油過氧化值增長最高為(56.43±5.17) mmol/kg。

表5 不同添加量的甾醇對核桃油過氧化值的影響

添加量100～200 mg/kg甾醇與空白核桃油過氧化值分析：第0～6天，過氧化值差異不顯著(P>0.05)；第6～10天，過氧化值差異顯著(P<0.05)；第12天，過氧化值差異不顯著；添加量200 mg/kg甾醇與空白核桃油過氧化值分析：第0～4天，過氧化值差異不顯著；第6～12天，過氧化值差異顯著；根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，甾醇最佳添加量為200 mg/kg。

濃度為100～200 mg/kg甾醇對核桃油其抗氧化作用隨著甾醇添加量的增大而增強(qiáng)；甾醇化合物對核桃油具有抗氧化作用的原因可能是因?yàn)殓薮纪ㄟ^直接與氧化產(chǎn)生的自由基反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，以達(dá)到抗氧化作用[20]。

2.2.1.2 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油過氧化值結(jié)果

從表6可看出，在添加量200 mg/kg的條件下，加速氧化后，未添加抗氧化劑的核桃油過氧化值增長最高；5種抗氧化劑對核桃油12 d后過氧化值高低依次為: TBHQ

表6 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油過氧化值的影響/mmol/kg

添加甾醇和空白核桃油樣過氧化值分析：第0～4天，差異不顯著；經(jīng)過4 d的引發(fā)誘導(dǎo)期，在第4～12天，差異顯著(P<0.05)；說明甾醇能延緩核桃油氧化?？赡苁怯捎诤颂矣椭戌薮己枯^低，添加甾醇是脂溶性抗氧化劑并且補(bǔ)充核桃油甾醇內(nèi)源性抗氧化成分含量，發(fā)揮其抗氧化能力。

添加甾醇和檸檬酸核桃油樣過氧化值分析：第0天，差異不顯著；第2天，添加檸檬酸比空白過氧化值高且差異顯著，但甾醇和空白差異不顯著，可能是由于核桃油自身抗氧化物質(zhì)存在，添加檸檬酸反而起到促氧化情況，此時甾醇并未出現(xiàn)促氧化情況；第4～12天，差異顯著，說明甾醇比檸檬酸抗氧化效果好； 添加甾醇和維生素E核桃油油樣過氧化值分析：第0天，差異不顯著；第2～12天，差異顯著；說明維生素E在核桃油中未能發(fā)揮較好抗氧化能力，甾醇抗氧化能力較好；趙雁武等[21]研究以β-谷甾醇為主蘋果籽油甾醇與維生素E對自由基清除能力，表明甾醇清除自由基的能力較維生素E高，本實(shí)驗(yàn)與此結(jié)果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油樣，第0～12天，差異顯著，說明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ和BHA；劉普等[22]發(fā)現(xiàn)幾種天然抗氧化劑提高牡丹籽油氧化穩(wěn)定性結(jié)果單獨(dú)使用天然抗氧化劑效果弱于TBHQ研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。

綜上所述，在相同儲藏時間、相同添加量時，5種抗氧化劑延緩核桃油氧化穩(wěn)定性的順序?yàn)?TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸，與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[23]。

2.2.2 酸值的分析

酸值是油脂中游離脂肪酸含量的標(biāo)志，所有核桃油樣品中的游離脂肪酸的含量增加，酸值變大，說明核桃油樣品氧化程度越高。

2.2.2.1 不同添加量甾醇對核桃油酸值結(jié)果

由表7可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通過恒溫干燥箱溫度為(60±1) ℃加速氧化12 d后，未添加甾醇的空白核桃油酸值增長最高為(1.157±0.042) mg/g。

表7 不同添加量的甾醇對核桃油酸值結(jié)果/mg/g

添加量100～150 mg/kg甾醇與空白核桃油酸值分析：第0～4天，差異不顯著(P>0.05)；第6天，差異顯著(P<0.05)；第6～8天，差異不顯著；第10～12天，差異顯著；說明添加量100～200 mg/kg甾醇延緩核桃油氧化，但甾醇添加量較低，抗氧化效果未能12 d內(nèi)均差異顯著。添加量200 mg/kg甾醇與空白核桃油酸值分析：第0～4天，酸值差異不顯著；第6～12天，酸值差異顯著；與過氧化值分析結(jié)果一致。

添加甾醇為100～200 mg/kg的核桃油樣酸值均低于空白核桃油，說明甾醇能夠抑制游離脂肪酸的增長，對核桃油均有較強(qiáng)的抗氧化作用；不同添加量甾醇其抗氧化作用隨著甾醇添加量的增大而增強(qiáng)；與過氧化值分析結(jié)果一致。

2.2.2.2 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油酸值結(jié)果

由表8可看出，通過溫度為(60±1) ℃加速氧化12 d后，空白核桃油樣的酸值最高；添加量200 mg/kg的條件下，5種抗氧化劑添加核桃油樣酸值高低依次為: 空白>檸檬酸、維生素E>甾醇>BHA>TBHQ。

表8 甾醇與不同抗氧化劑對核桃油酸值結(jié)果/mg/g

添加甾醇和檸檬酸核桃油樣酸值分析：第0天，差異不顯著，第2～12天，差異顯著(P<0.05)，說明甾醇具有抗氧化性，且明顯優(yōu)于天然抗氧化劑檸檬酸，與過氧化值分析結(jié)果一致。

添加甾醇和維生素E核桃油樣酸值分析：第0天，差異不顯著，第2～12天，差異顯著，說明甾醇抗氧化優(yōu)于天然抗氧化劑維生素E，與過氧化值分析結(jié)果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油樣，第0～12天，差異顯著，說明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ、BHA，與過氧化值分析結(jié)果一致。

在相同儲藏時間、相同添加量時，5種抗氧化劑延緩核桃油氧化穩(wěn)定性的順序?yàn)?TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸。

2.2.3 甾醇與檸檬酸、維生素E復(fù)配研究結(jié)果

2.2.3.1 響應(yīng)面回歸模型方差分析

表9 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表10 回歸模型方差分析結(jié)果

因此可用此回歸模型分析和預(yù)測甾醇、檸檬酸和維生素E對核桃油過氧化值影響。結(jié)果顯示，甾醇添加量的一次項(xiàng)A對過氧化值影響顯著(P<0.05)，檸檬酸和維生素E添加量一次項(xiàng)B和C對過氧化值影響不顯著(P>0.05)，此結(jié)果與過氧化值和酸值的研究結(jié)果一致。由圖4可知，當(dāng)維生素E添加量一定時，檸檬酸添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨著添加量的增大而平緩減小；甾醇添加量為100～200 mg/kg，核桃油過氧化值隨添加量的增大而減小，說明甾醇對核桃油具有抗氧化作用，且隨甾醇添加量的增加抗氧化能力增大；等高線結(jié)果說明甾醇與檸檬酸交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖4 甾醇與檸檬酸交互作用對過氧化值影響的響應(yīng)面圖

由圖5可知，當(dāng)檸檬酸添加量一定時，維生素E添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而平緩減?。荤薮继砑恿吭?00～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而減小。等高線結(jié)果說明甾醇與維生素E交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖5 甾醇與維生素E交互作用對過氧化值影響的響應(yīng)面圖

由圖6可知，當(dāng)甾醇添加量一定時，檸檬酸添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值也隨添加量的增大而先平緩減小后平緩增大；維生素E添加量在100～200 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油過氧化值隨添加量的增大而先平緩減小后平緩增大。等高線結(jié)果說明檸檬酸與維生素E交互作用對核桃油過氧化值影響不顯著。

圖6 檸檬酸與維生素E交互作用對過氧化值影響的響應(yīng)面圖

2.2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

用模型分析可知，最佳復(fù)配組合是200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg檸檬酸、174.66 mg/kg維生素E，過氧化值預(yù)測值為14.36 mmol/kg。按最佳復(fù)配組合參數(shù)驗(yàn)證，過氧化值實(shí)驗(yàn)值為14.44 mmol/kg，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本一致。通過表10和表6可知，復(fù)配組合過氧化值比美藤果油甾醇(29.87±1.98) mmol/kg過氧化值小，接近BHA的過氧化值(8.80±0.70)mmol/kg，說明復(fù)配組合對核桃油的抗氧化效果比添加單一甾醇好，和BHA抗氧化效果接近。研究表明，復(fù)配抗氧化劑可提高油脂氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)，如茶多酚和維生素E等復(fù)配，提高棉籽油氧化穩(wěn)定性[24]。

3 結(jié)論

將美藤果仁物理壓榨得到美藤果油毛油，美藤果油中甾醇物質(zhì)主要是β-谷甾醇和豆甾醇，豆甾醇含量為(68.74±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量為(156.47±0.46) mg/100 g；美藤果油豆甾醇平均回收率為102.1%，RSD為0.71%；β-谷甾醇平均回收率為103.9%，RSD為0.56%。

當(dāng)甾醇的添加量為200 mg/kg 對核桃油抗氧化效果最佳，與空白組差異顯著(P<0.05)；與添加檸檬酸、維生素E核桃油樣差異顯著(P<0.05)；與添加TBHQ、 BHA核桃油樣差異顯著(P<0.05)；5種抗氧化劑對核桃油抗氧化作用效果依次為: TBHQ>BHA>甾醇>維生素E、檸檬酸。甾醇與檸檬酸、維生素E復(fù)配，最佳添加量配方為200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg檸檬酸、174.66 mg/kg維生素E，過氧化值為14.44 mmol/kg，復(fù)配組合過氧化值接近添加BHA(8.80±0.70)mmol/kg的過氧化值，說明甾醇及復(fù)配天然抗氧化劑對核桃油的氧化穩(wěn)定性有一定抗氧化作用。

不同油脂的氧化穩(wěn)定性不同可能與油脂中甾醇的種類及含量不同有關(guān)，甾醇對核桃油能在一定程度上抑制油脂氧化酸敗，究其原因，甾醇是油脂中脂溶性天然抗氧化物質(zhì)，加入核桃油中，補(bǔ)充核桃油甾醇內(nèi)源性抗氧化成分，發(fā)揮抗氧化效果；因此甾醇是一種具有開發(fā)潛力的天然脂溶性抗氧化劑，但甾醇對油脂抗氧化機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。