鄭牧垚

摘 要：鹽膚木果實(shí)中沒(méi)食子酸等多酚類物質(zhì)是重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗病毒、消腫瘤等多種生物學(xué)活性。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS），分別對(duì)壓榨法、乙醚浸提法和超臨界CO2萃取法3種提取方法所得鹽膚木果油中沒(méi)食子酸等多酚成分進(jìn)行了定性分析，再以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)各樣品中沒(méi)食子酸含量進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明：3種樣品中均檢測(cè)到?jīng)]食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之間，但不同樣品中沒(méi)食子酸含量差異顯著，即提取鹽膚木果油的方式不同，其油脂中含沒(méi)食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中樣品中沒(méi)食子酸最多，達(dá)（426.7±7.7）mg/L。該研究可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用鹽膚木果油資源提供方法借鑒。

關(guān)鍵詞：沒(méi)食子酸;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析;高效液相色譜法;鹽膚木;果油

鹽膚木是漆樹(shù)科鹽膚木屬的落葉小喬木或灌木，其在我國(guó)分布廣泛，除東北、新疆和內(nèi)蒙古外，其余各省區(qū)均有分布[1]。鹽膚木是中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物，其根、莖、葉、果實(shí)及五倍子均可入藥，具有祛風(fēng)化濕、消腫軟堅(jiān)、收斂解毒、生津潤(rùn)肺、降火化痰等功效[2]。鹽膚木樹(shù)上所產(chǎn)的五倍子主要成分為鞣酸（單寧酸）、沒(méi)食子酸及綠原酸等。沒(méi)食子酸，又名倍酸、3，4，5-三羥基苯甲酸，常用作抗氧化劑，具有抗炎癥、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性[3]，在食品、生物、醫(yī)藥化工等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[4]。鹽膚木果油富含不飽和脂肪酸，其不飽和脂肪酸含量可達(dá)72%，極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值[5-7]，作為木本油料，鹽膚木果油已被批準(zhǔn)為新資源食品（衛(wèi)生部公告2013年第1號(hào)），而鹽膚木果油中沒(méi)食子酸等多酚類物質(zhì)有無(wú)及其含量高低，是其品質(zhì)高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。對(duì)鹽膚木果實(shí)及果油中沒(méi)食子酸等多酚成分及其含量的研究，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用鹽膚木資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超臨界CO2萃取裝置，南通市華安超臨界萃取有限公司;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫1290II，Q-TOF，含單四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)量分析器;高效液相色譜，依利特P230II含紫外檢測(cè)器;超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;電子天平（FA1204N），上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;粉碎機(jī)（DXP-20C），廣州市大祥電子機(jī)械有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGT-G250），合肥華德利科學(xué)器材有限公司;小型榨油機(jī)。

1.2 材料與主要試劑

鹽膚木果實(shí)，采自安徽六安佛子嶺，曬干后冰柜中保存;色譜純甲醇，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?磷酸，AR，國(guó)隴化工股份有限公司;質(zhì)譜純甲醇，法國(guó)默克公司;甲酸，質(zhì)譜純;水，市售瓶裝娃哈哈純凈水;沒(méi)食子酸，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，上海原液生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽膚木果油的提取 （1）壓榨法：將鹽膚木果過(guò)篩去除雜質(zhì)后，用小型榨油機(jī)壓榨，得到鹽膚木果壓榨毛油。（2）乙醚浸提法：將鹽膚木果實(shí)清洗干凈，烘干至恒重，粉碎過(guò)篩，采用索氏抽提法，以無(wú)水乙醚為提脂劑，于45 ℃水浴加熱回流抽提3～5 h，直至回流液無(wú)色，用玻璃棒蘸取回流液于濾紙上風(fēng)干后無(wú)印記為止，充分提取鹽膚木果油及其他脂溶性物質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)去除乙醚，并在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)45 ℃烘至恒重，即得鹽膚木果實(shí)乙醚浸提油。（3）超臨界萃取法：將鹽膚木果實(shí)置60～70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎成80～100目的粉末，稱取300～400 g該粉末，裝入料筒后放于萃取釜中，設(shè)定超臨界CO2萃取的條件分別是：萃取壓力25 MPa、萃取溫度40 ℃、分離壓力10 MPa、分離溫度50 ℃、萃取時(shí)間2 h，即每30 min收集萃取油脂1次，重復(fù)收集4次，即得超臨界CO2萃取鹽膚木果油。

1.3.2 分析樣品的處理 由于鹽膚木果油粘稠而成分復(fù)雜，如果用該油脂直接進(jìn)樣進(jìn)行HPLC或UPLC-MS分析，其油脂成分又是多酚類成分分析的干擾雜質(zhì)，油脂成分相對(duì)于多酚類物質(zhì)含量又過(guò)高，因此，必須除去絕大部分油脂成分。利用多酚類物質(zhì)易溶于甲醇、乙醇等醇類溶劑的特性，在測(cè)定前，用甲醇萃取出油脂中的多酚類成分。具體方法：分別準(zhǔn)確吸取以上制備的各種鹽膚木果油1 mL，加入質(zhì)譜純甲醇1 mL，充分振蕩后靜置24 h，吸取醇層，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得UPLC-MS分析或HPLC分析所需的樣液。因此，每mL如此處理的樣品所含沒(méi)食子酸的量視為等同于同體積鹽膚木果油中沒(méi)食子酸含量。

1.4 沒(méi)食子酸的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）分析鑒定

1.4.1 超高效液相色譜（UPLC）條件[7，9-11] Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速0.25 mL/min，流動(dòng)相A為0.1%質(zhì)譜甲酸水溶液，B為質(zhì)譜甲醇（表1）。

1.4.2 質(zhì)譜（MS）條件 電子電離（EI），負(fù)離子模式，單四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，分子分離器條件：干燥氣（N2）流速10 L/min，溫度320 ℃;鞘氣：280 ℃，流速為11 L/min;霧化器噴霧壓力35 psi。

1.4.3 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)的確定 單四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)量分析器進(jìn)行掃描的時(shí)候，有2個(gè)關(guān)鍵的檢測(cè)參數(shù)，一個(gè)是一級(jí)質(zhì)譜的電離電壓，另一個(gè)是二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能，在最優(yōu)的電離電壓下樣品分子會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定的母離子，在最優(yōu)的碰撞能下，產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜的子離子數(shù)是最大的，因此測(cè)定不同的物質(zhì)，2個(gè)參數(shù)都需要經(jīng)過(guò)儀器條件的優(yōu)化，然后才能在最優(yōu)參數(shù)下進(jìn)行定量和定性分析。經(jīng)電離電壓設(shè)定為145～175 V的沒(méi)食子酸一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)子流（M/Z=169.016）大小可見(jiàn)，在145 V時(shí)最大，出峰最好;由碰撞能為10～40 eV時(shí)沒(méi)食子酸二級(jí)質(zhì)譜圖可看出，沒(méi)食子酸二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)子流（M/Z=125.026）在碰撞能為20 eV時(shí)最好。因此，鹽膚木果油中沒(méi)食子酸的最優(yōu)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果是：一級(jí)質(zhì)譜的電離電壓為145 V，二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能為20 eV[7]。

1.5 高效液相色譜（HPLC）紫外檢測(cè)含量測(cè)定

1.5.1 HPLC色譜條件[12-13] ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相：A為色譜甲醇，B為0.1%磷酸水溶液，流速1 mL/min（表2）。

1.5.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇∶0.1%磷酸水=80∶20的流動(dòng)相溶液稀釋成梯度濃度分別是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按上述1.5.1的HPLC色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)行測(cè)定（圖3），將測(cè)定結(jié)果以峰面積（mAU.s）為縱坐標(biāo)Y、沒(méi)食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），得到回歸方程。

1.5.3 樣品中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定 按照沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的同樣條件，對(duì)各樣品進(jìn)行進(jìn)樣分析，將各樣品的HPLC峰面積數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出各樣品中的沒(méi)食子酸含量（mg/mL）（表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸的液質(zhì)聯(lián)用分析鑒定結(jié)果

2.1.1 常見(jiàn)多酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一級(jí)質(zhì)譜及沒(méi)食子酸的一、二級(jí)質(zhì)譜 按上述1.4 UPLC-MS的條件，對(duì)鹽膚木中常見(jiàn)的5種多酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品（沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸和漆酚）的混標(biāo)溶液進(jìn)行UPLC-MS分析，一級(jí)質(zhì)譜總離子流色譜圖可見(jiàn)，沒(méi)食子酸的負(fù)離子模式（M/Z=169.016）一級(jí)質(zhì)譜總離子流出峰時(shí)間是1.321 min，其二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子（M/Z=125.02）較穩(wěn)定（圖1）。

2.1.2 鹽膚木果油樣品中沒(méi)食子酸的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜定性分析結(jié)果 按上述1.4UPLC-MS的條件，對(duì)3種方式提取的鹽膚木果油樣品進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜分析的結(jié)果可見(jiàn)，壓榨鹽膚木果油樣品、乙醚萃取及超臨界CO2萃取鹽膚木果油樣品中一級(jí)質(zhì)譜中總離子流出峰時(shí)間在1.32左右均有一個(gè)質(zhì)荷比M/Z=169.016的較強(qiáng)的離子峰，其二級(jí)質(zhì)譜中質(zhì)荷比為M/Z=125.02的離子流也較穩(wěn)定，說(shuō)明3種方式提取鹽膚木果油中均含有多酚類物質(zhì)——沒(méi)食子酸（圖2）。

2.2 HPLC紫外檢測(cè)含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列的HPLC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列的HPLC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3、圖4。

2.2.2 各樣品中沒(méi)食子酸的HPLC圖譜及其含量 3種樣品在沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品相同色譜條件下的HPLC圖譜見(jiàn)圖5，將各自峰面積數(shù)值輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出各自的沒(méi)食子酸含量（表3）。

由表3可見(jiàn)，3種樣品中均檢測(cè)到?jīng)]食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之間;但不同樣品中沒(méi)食子酸含量差異顯著，即提取鹽膚木果油的方式不同，其油脂中含沒(méi)食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中樣品中沒(méi)食子酸最多，達(dá)（426.7±7.7）mg/L。

3 討論

采用UPLC-MS定性分析可以確定不同提取方法所得鹽膚木油脂中均含有沒(méi)食子酸，該方法正是目前對(duì)未知成分定性分析的通用的方法，也是較準(zhǔn)確的方法之一。而HPLC的紫外檢測(cè)定量分析更是較普及的定量檢測(cè)方法之一。

從分析結(jié)果可以看出，鹽膚木果油提取方法不同，其中所含沒(méi)食子酸的量存在顯著差異，乙醚浸提鹽膚木果油中含量是壓榨法或超臨界CO2萃取法所得鹽膚木果油中的7～8倍之多，可能的原因：一是沒(méi)食子酸性質(zhì)決定的，沒(méi)食子酸易溶于熱水、乙醇、乙醚，而不溶于苯、石油醚等[14]，因此，乙醚提取鹽膚木果油時(shí)，沒(méi)食子酸也就留在了油脂中。二是不同提取方式提取鹽膚木果油所用的原料鹽膚木果實(shí)的材料來(lái)源于不同批次，也就是不同植株的鹽膚木果實(shí)，這些原材料中所含沒(méi)食子酸含量也可能有所差異。因此，鹽膚木不同植株或不同生長(zhǎng)環(huán)境條件下其果實(shí)中的沒(méi)食子酸含量，也有待深入研究。

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