劉展良 張慧柔 吳曉蓉 譚清華 李伊琳 林忠曉

摘 要：目的：探索微堆發(fā)酵法制造的普洱茶對人肺NCI-H1299細胞的影響，為肺癌的預(yù)防及輔助治療提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用微堆發(fā)酵法生產(chǎn)普洱茶，并將其提取液作用于人肺NCI-H1299細胞，采用WST-1 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測H1299細胞的增殖情況、采用細胞劃痕愈合法檢測H1299細胞的遷移情況、采用Transwell細胞體外侵襲實驗法檢測H1299細胞的侵襲能力。結(jié)果：微堆發(fā)酵法生產(chǎn)出的普洱茶符合國家標(biāo)準(zhǔn);該普洱茶提取液能有效抑制NCI-H1299細胞的增殖（P<0.01）、遷移（P<0.01）與侵襲（P<0.05），且呈濃度依賴性。結(jié)論：微堆發(fā)酵法生產(chǎn)的普洱茶能夠抑制人非小細胞肺癌H1299的增殖、遷移和侵襲。

關(guān)鍵詞：微堆發(fā)酵;普洱茶;細胞增殖;細胞遷移;侵襲

肺癌主要分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC占了肺癌的85%，而那些未得到有效治療的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的生存期僅有短短的4～5個月，1年的生存率更是低到僅有10%[1-3]，NSCLC患者總體的5年生存率仍舊只有15%[4]。

以普洱茶樹葉子加工成的生曬毛茶再經(jīng)過渥堆發(fā)酵成普洱熟茶，在加工過程中微生物代謝產(chǎn)生的胞外酶和濕熱作用下，產(chǎn)生茶多糖、茶色素、人體必需氨基酸、酶和礦物質(zhì)，并含益生菌[5-9]。本研究探索微堆發(fā)酵方法（30～100 kg生曬毛茶為原料）能否生產(chǎn)出合格的普洱茶，并將該普洱茶湯作用于肺癌細胞，為肺癌的預(yù)防保健和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱生曬毛茶，云南省勐臘縣易武山古茶樹新稍為原料加工而成（實用新型專利：2017202876680.9）;人非小細胞肺癌H1299細胞，廣州一駿生物制品有限公司;DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司;胎牛血清，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司;0.25%胰蛋白酶，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;不含鈣離子和鎂離子的PBS緩沖液，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司;BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)，北京凱樂思科技有限公司;結(jié)晶紫染色液，北京索萊寶科技有限公司;含4%多聚甲醇的通用型組織固定液，武漢賽維爾生物科技有限公司;BSA，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Transwell檢測試劑盒，康寧（上海）管理有限公司;WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alrstream Ⅱ級A2型生物安全柜（AC2-6S1型），浩瀚（香港）有限公司;Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱（FORMA SERIES Ⅱ WATER JACKET），美國Thermo公司;德國eppendorf低速冷凍離心機（centrifuge5702R型），上海艾研生物科技有限公司;熒光倒置顯微鏡（EVOS fl型），北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;正倒置一體熒光顯微鏡（EchoRevolve型），北京深藍云生物科技有限公司;恒溫水浴搖床（SBS40型），北京諾植科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型），上海亞榮生化儀器廠;美的冰箱（BCD-530WKM），合肥美的電冰箱有限公司;超低溫保存箱（MDF-U700VXL-PC型），日本松下健康醫(yī)療器械株式會社;全功能微孔分析儀（Mithras2 LB943型），廣州云星科學(xué)儀器有限公司;德國Memmert高溫烘箱（UF260型），瑞軒電子科技（上海）有限公司;萬分之一天平（BSA323-CW型），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微堆發(fā)酵生產(chǎn)普洱茶 以50.0 kg易武生曬毛茶為原料，潮水經(jīng)45 d微堆發(fā)酵，最終得到42.1 kg產(chǎn)品，產(chǎn)率達84.2%。

1.3.2 細胞培養(yǎng)基的配置與實驗分組 細胞使用DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液[基礎(chǔ)DMEM（1X）培養(yǎng)基∶FBS∶雙抗溶液=9∶1∶0.1]進行培養(yǎng)，配置后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱中冷藏備用，使用時37 ℃復(fù)溫。實驗分為試驗組與對照組，試驗組為H1299細胞+ DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液+培養(yǎng)基稀釋不同濃度的普洱茶提取液（100%、50%、20%、10%、5%）;陰性對照組為H1299細胞+DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液;空白細胞對照組為DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液。

1.3.3 普洱茶提取液的獲取 適量普洱茶于研缽中研磨成茶粉，用千分之一天平稱取2.000 g普洱茶粉，倒入500 mL燒杯中，加入250 mL超純水?dāng)嚢杈鶆?，隨后放置于微波爐中用中高火加熱10 min，取出用干凈紗布將茶湯過濾，棄茶渣，隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，結(jié)束后將濃縮的普洱茶提取液轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶內(nèi)密封好，巴氏殺菌法在65 ℃烘箱中放置30 min，隨后取出立即存放于4 ℃冰箱使普洱茶提取液的溫度驟降，達到殺菌目的，留以備用，隨后，超凈臺內(nèi)再次用0.22 μm針筒式濾膜過濾器過濾除去細菌。

普洱茶水提取液含量（%）=（1 mL普洱茶提取液的質(zhì)量-1 mL純水質(zhì)量）/1mL普洱茶提取液的質(zhì)量×100%（1）

1.3.4 腫瘤細胞增殖的測定 收集對數(shù)生長期的H1299細胞制備細胞懸液，于96孔板中加入H1299細胞，100 μL /孔（約5 000個），放置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄舊培養(yǎng)基，并按試驗組與對照組的設(shè)計要求加入DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液及普洱茶提取液，孵育適當(dāng)時間，加入WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑（唑鹽工作液）10 μL，二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。于450 nm波長處檢測每孔的吸光度，用OD值表示。將各測試孔的OD值減去空白無細胞OD值，各重復(fù)孔的OD值取均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示、T為加藥細胞的OD值、C為對照細胞的OD值。

細胞存活率（%）=（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100%（2）

1.3.5 腫瘤細胞遷移的測定 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H1299細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化并制備成細胞懸液，進行細胞計數(shù)，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞密度為5×105/孔，接種于12孔板中（1 mL/孔），每孔加入1 mL調(diào)整好的細胞懸液后，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，貼壁后用1 mL無菌移液頭在12孔板內(nèi)的每孔垂直劃痕（近孔中線處），盡量保持每孔的劃痕大小一致，隨后用PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，按實驗分組加入試驗藥物及DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液。放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡分別觀察記錄第0、6、12、24、48 h的細胞遷移情況，并計算4×視野內(nèi)遷移劃痕的面積變化。劃痕的愈合率越高，表明細胞的遷移能力越強。

劃痕愈合率=（初始劃痕面積-觀察時間點劃痕面積）/ 初始劃痕面積×100%（3）

1.3.6 腫瘤細胞侵襲的測定 （1）鋪Matrigel基質(zhì)膠∶按Matrigel基質(zhì)膠∶無血清DMEM基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基=1∶8的比例混勻，取200 μL稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠均勻涂抹于每個Transwell小室的聚碳酸酯膜上面（冰面上進行），隨后放置二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中孵育5 h。取出Transwell小室轉(zhuǎn)移至超凈操作臺，吸去未貼壁的Matrigel基質(zhì)膠，上室加入400 μL水浴恒溫至37 ℃的DMEM（1X）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含胎牛血清），下室則加入1 000 μL，隨后放置二氧化碳培養(yǎng)箱中待其水化2 h。（2）細胞饑餓培養(yǎng)：收集已用DMEM（1X）高糖培養(yǎng)液在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至融合度達90%的H1299細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化后，加入DMEM（1X）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含胎牛血清），靜置培養(yǎng)24 h以備用。（3）侵襲過程：已饑餓培養(yǎng)24 h的H1299細胞，棄舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍后，消化，含0.1%胎牛血清和0.1% BSA的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×105/mL。上室加入400 μL H1299細胞懸液及不同濃度（50%、20%、10%）普洱茶液提取液，下室加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM（1X）高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，靜置干燥，無菌棉球輕輕擦拭上室內(nèi)貼壁細胞，用含4%多聚甲醇的通用型組織固定液固定細胞10 min，吸棄固定液，再用PBS磷酸鹽緩沖液沖洗細胞2遍，隨后用1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，染色結(jié)束用PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2遍。（4）細胞染色與處理：將結(jié)晶紫染好色的Transwell小室放在載玻片上，并置于熒光倒置顯微鏡下觀察，遵循隨機原則選擇20×視野5個進行拍照，采用ImageJ系統(tǒng)計算穿越小室的細胞數(shù)量，計算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果用±s表示。采用GraphPad Prism 6處理數(shù)據(jù)并進行顯著性分析，P<0.05認為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微堆發(fā)酵普洱茶產(chǎn)出及理化檢測結(jié)果

50.0 kg易武生曬毛茶為原料，經(jīng)45 d微堆發(fā)酵，最終得到42.1 kg產(chǎn)品，產(chǎn)率達84.2%。發(fā)酵產(chǎn)出率較高。產(chǎn)品外觀條索緊細勻整、色澤紅褐潤顯毫，茶湯陳香濃郁、紅艷明亮，滋味濃醇甘爽;含水量8.7%，水提取液含量38.9%（國家標(biāo)準(zhǔn)要求≥28%），多酚總量13.5%（國家標(biāo)準(zhǔn)要求≤15.0%）。

2.2 普洱茶水提取液含量測定

本研究所用普洱茶提取液（100%）的普洱茶水提取液含量為（10.72±0.32）%。

2.3 普洱茶提取液對H1299細胞增殖的影響

增殖實驗原理是活細胞會與本檢測試劑中的疊氮類四唑鹽生成甲臜，而生成的甲臜量與細胞活力成正比，進而通過檢測各孔板孔吸光度的差異判斷細胞活力[10-11]。不同濃度普洱茶提取液作用于NCI-H1299細胞24 h及48 h后，隨著濃度的提高，細胞活力顯著下降（圖1），每一實驗組兩兩對比，可見細胞生長受到明顯的抑制作用，表明抑制效應(yīng)表現(xiàn)為濃度依賴性，即處理時間相同時，隨處理濃度的增加，細胞增殖的存活率便隨之減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1、圖2）。

2.4 普洱茶提取液對H1299細胞遷移的影響

本研究采用細胞劃痕法測定普洱茶提取液對人肺NCI-H1299細胞遷移能力的影響，該法是測定腫瘤細胞的運動特性的方法之一，其借鑒體外細胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細胞上劃痕致傷，然后加入試24 h及48 h后的存活率。

2.5 普洱茶提取液對H1299細胞侵襲的影響

在體外細胞模擬實驗中，Transwell結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度普洱茶提取液處理的NCI-H1299細胞與空白對照組相比，試驗組侵襲的細胞數(shù)量顯著低于空白對照組，并呈濃度依賴性，即指在相同處理時間下，普洱茶提取液的濃度越高，細胞侵襲數(shù)量越少，細胞侵襲能力下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表3、圖4）。

3 結(jié)論

本研究利用NCI-H1299細胞系考察不同濃度普洱茶提取液（10%、20%、50%、100%）對肺癌細胞體外增殖的抑制作用，并根據(jù)實驗結(jié)果分別選取了濃度為10%、20%、50%（24 h存活率依次為85.54%、76.66%、47.23%;48 h存活率依次為83.02%、73.94%、42.98%）的普洱茶提取液作用于NCI-H1299細胞24 h進行后續(xù)的遷移和侵襲實驗，以減少肺癌細胞生長增殖對其遷移和侵襲造成的干擾。研究結(jié)果表明，經(jīng)過上述濃度普洱茶提取液處理后，NCI-H1299細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力均受到抑制作用，且呈濃度依賴性，即隨著普洱茶提取液濃度的增大，其產(chǎn)生的抑制作用越明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。本研究表明，微堆發(fā)酵能產(chǎn)生品質(zhì)合格的普洱茶，不同濃度該普洱茶提取液均可以抑制NCI-H1299細胞的增殖、遷移及侵襲，并且其抑制作用隨普洱茶提取液濃度的提高而增大，表明普洱茶能夠抑制肺癌的發(fā)展。

4 討論

茶多酚可抑制并阻斷人體內(nèi)的亞硝化反應(yīng)，減少亞硝胺含量從而抑制致癌物的生成[14]。茶色素通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2、環(huán)加氧酶2、G蛋白信息調(diào)節(jié)因子基因、表皮生長因子等細胞信號分子以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)而達到抗腫瘤的效果[15]。云南普洱茶所含茶多酚較高，經(jīng)過渥堆發(fā)酵的熟茶仍保留了一定的茶多酚，同時產(chǎn)生比例較高的茶色素，為其抑制人非小細胞NCI-H1299的體外增殖、遷移和侵襲能力打下物質(zhì)基礎(chǔ)。

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