唐 倩 肖華西 孫術(shù)國 林親錄 唐瑋澤

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長沙 410004)

目前對(duì)黑米中花色苷的研究主要可以分為兩個(gè)方面：一是花色苷的提取純化及其分子結(jié)構(gòu)分析，二是花色苷的生物活性研究。從黑米中提取的花色苷, 除了表現(xiàn)出亮麗的色澤，還具有抗氧化、延緩衰老、抑菌抗炎、降血糖、降血脂、抑癌抗癌和改善視力、緩解肝功能障礙等多種生理功能，特別是矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷，對(duì)癌細(xì)胞增殖有體外抑制作用[1]，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激有很好的保護(hù)作用[2]，對(duì)血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的生成的血管也具有保護(hù)功效[3]，在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面均得到了廣泛的應(yīng)用。Kaneda等[4]對(duì)黑米皮提取物的生物活性研究結(jié)果表明矢車菊素-3-葡萄糖苷不僅是黑米中重要的抗氧化成分，而且具有極強(qiáng)的自由基清除能力并且可以保護(hù)表皮細(xì)胞免收紫外線損傷。Chang等[5]研究了黑米花色苷提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用，結(jié)果表明黑米花色苷可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管再生的方式抑制乳腺癌細(xì)胞生長。Morimitsu等[6]研究表明從黑米中提取的矢車菊素-3-葡萄糖苷對(duì)糖尿病型白內(nèi)障形成表現(xiàn)出了良好的抑制作用。

糧食品質(zhì)變化不僅僅由于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和淀粉的影響，稻米胚乳形態(tài)結(jié)構(gòu)和各種物質(zhì)成分的分布特點(diǎn)以及結(jié)合方式是反映糧食儲(chǔ)藏品質(zhì)的重要因素[7]。稻谷在儲(chǔ)藏過程中，微觀結(jié)構(gòu)上的細(xì)小變化會(huì)引起米粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，從而發(fā)生相應(yīng)的生理、化學(xué)變化，并最終導(dǎo)致稻谷的食用、加工、儲(chǔ)藏品質(zhì)發(fā)生變化[8]。丁超等[9]通過比較儲(chǔ)藏期間稻谷、糙米及精米橫截面微觀結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，所有稻米樣品內(nèi)部蛋白質(zhì)和淀粉顆粒分別出現(xiàn)不同程度的聚集，顆粒結(jié)構(gòu)趨于緊湊，細(xì)胞壁逐漸消失，顆粒內(nèi)部組分的排列趨于凌亂。谷物儲(chǔ)藏過程中，隨著生理代謝的變化，其生理活動(dòng)和營養(yǎng)品質(zhì)都會(huì)改變，蛋白質(zhì)是糧食的重要組成成分在儲(chǔ)藏過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化。楊衛(wèi)梅等[10]應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)不同儲(chǔ)藏年份的谷物種子進(jìn)行區(qū)分研究，結(jié)果顯示谷物種子隨著儲(chǔ)藏年份增加，自動(dòng)峰和交叉峰的數(shù)目減少且強(qiáng)度減弱。趙娟紅[11]采用傅里葉紅外光譜對(duì)不同溫度下儲(chǔ)藏的寧鄉(xiāng)黑豬肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定得知隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨向于從有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，β -折疊和β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量顯著減少，α-螺旋相對(duì)含量和無規(guī)則卷曲相對(duì)含量顯著上升。

本實(shí)驗(yàn)探究不同花色苷含量的黑米在儲(chǔ)藏過程中花色苷的鑒定及各單體含量的變化及其變化規(guī)律，以及對(duì)黑米微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的觀察分析，為黑米儲(chǔ)藏機(jī)理的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糧田黑1405(黑秈黏米)、糧田黑1501(黑粳糯米)、糧田黑1301(黑粳糯米)、糧田黑1505(黑秈黏米)；芍藥素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品；甲酸；甲醇；溴化鉀、無水乙醇：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，JSM-6700型掃描電鏡，IRTracer-100型傅里葉紅外光譜儀，API 4000型LC/MS/MS高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 花色苷的鑒定及單體含量的測(cè)定

1.3.1.1 檢測(cè)樣品的配制

花色苷溶液的提?。涸诤诎禇l件下，用總計(jì)15 mL甲醇：1 mol/L HCl(85：15)，用搖床3次提取0.5 g米粉，然后在4 100 g下在室溫下離心15 min，清澈的上清液即為花色苷提取液。

樣品溶液的配制：取不同樣品的提取溶液1 mL于容量瓶中，加適量色譜級(jí)甲醇溶解，利用超聲波進(jìn)一步溶解后定容至刻度，再用0.2%色譜級(jí)甲酸水溶液逐級(jí)稀釋多倍后進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣前使用0.45 μm的微孔濾膜濾過。

對(duì)照樣品的配制：取一定量的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品化合物分別用甲酸稀釋配制成5個(gè)不同濃度溶液。

1.3.1.2 色譜條件

色譜柱：TC-C18，150 mm×4.6 mm×5 μm， 柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min，檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為含1.0%甲酸的水溶液，B為含甲醇溶液，A+B=70+30；等度洗脫。采集波長：523 nm；采集時(shí)間：15 min。

1.3.1.3 質(zhì)譜條件

電離電壓：3 500 V，干燥溫度：350 ℃，離子傳輸管溫度：350 ℃。離子對(duì)信息：定量離子對(duì)：463.186：301.135(21 eV)，定性離子對(duì)：463.186：258.064(44 eV)。所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mass Hunter 8.0軟件進(jìn)行采集和分析。

1.3.1.4 定量分析

參照付鑫景[12]的方法采用外標(biāo)法對(duì)黑米中花色苷單體進(jìn)行定量。按照色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(40～5 000 ng/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，五點(diǎn)外標(biāo)法繪制標(biāo)曲線。進(jìn)行定量分析，以信噪比S/N=10時(shí)確定該方法的定量限(LOQ)，以信噪比S/N=3時(shí)確定該方法的檢測(cè)限(LOD)，通過峰面積對(duì)HPLC的精密度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

黑米的微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法參照朱芳芳等[13]的方法，將黑米去殼后，得到糙米，再將糙米夾在開叉的鑷子上，用小刀背在樣品的中部施壓，使其自然斷裂。用小刀切下斷裂部，制成3 mm厚的樣品，斷面向上，樣品用雙面膠帶紙黏附于銅樣臺(tái)上，對(duì)斷面噴金。置樣品于JSM-6700型掃描電鏡下觀察糙米斷面的背部、中部和腹部并攝影，加速電壓20 kV，分別放大35倍、2 000倍和5 000倍。

1.3.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

取一定量的充分干燥的溴化鉀，放入瑪瑙研缽中在鎢燈充分研磨至不見晶體。稱取1 mg 充分干燥過的黑米粉放入研缽中，取200 mg研磨好的溴化鉀與之充分混合均勻，壓制成薄片。利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行全波段(400～4 000 cm-1)掃描，掃描次數(shù)為132次；得到的譜圖通過Omnic 8.2軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米儲(chǔ)藏過程中花色苷的鑒定及單體含量的測(cè)定

2.1.1 黑米花色苷提取物的組分分析

對(duì)黑米中花色苷高效成分進(jìn)行分析，由結(jié)果可知4種黑米的液相圖基本一致，均在2.38、9.28、25.33 min三處出峰，說明4種黑米花色苷提取物在單體組成上沒有差別，只是各單體的相對(duì)含量不同。利用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得化學(xué)成分的準(zhǔn)分子離子峰，確定可能分子量；根據(jù)正負(fù)離子模式下獲得的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得相關(guān)結(jié)構(gòu)碎片離子信息，參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖信息，共鑒定出3種化合物，分別是芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-葡萄糖苷，具體見表1。

表1 黑米花色苷鑒定

2.1.2 黑米儲(chǔ)藏過程中花色苷單體的定量分析

由圖1可知，4種黑米的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量在儲(chǔ)藏過程中均發(fā)生了變化，但是并沒有明顯的隨儲(chǔ)藏時(shí)間變化的規(guī)律。值得注意的是，4種黑米中的芍藥素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量在儲(chǔ)藏前后大體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中就芍藥素-3-O-葡萄糖苷而言，糧田黑1501從儲(chǔ)藏前期的790.00 μg/g先下降到550.00 μg/g后又回升到700.00 μg/g，其整體下降率為11.39 μg/g；糧田黑1505的程度最大，從儲(chǔ)藏前期的480.00 μg/g先下降到300.00 μg/g后回升到390.00 μg/g，整體下降率為18.75%。此外，糧田黑1501和糧田黑1505在儲(chǔ)藏前后的變化程度較糧田黑1405和糧田黑1301的變化程度更大，黑米中花色苷因具有酚羥基結(jié)構(gòu)

圖1 黑米儲(chǔ)藏過程中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量的變化

而具有抗氧化、清除自由基等活性，且花色苷含量越高，對(duì)自由基等清除能力越強(qiáng)，這可能說明糧田黑1501和糧田黑1505在儲(chǔ)藏過程中清除自由基數(shù)量及能力優(yōu)于糧田黑1405和糧田黑1301。

2.2 黑米儲(chǔ)藏過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化(胚乳橫斷面掃描電鏡觀察)

圖2顯示了4種黑米儲(chǔ)藏過程中整體和內(nèi)部淀粉顆粒結(jié)構(gòu)變化。觀察放大35倍掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)，4種黑米在儲(chǔ)藏前期的橫截面均無明顯裂紋，儲(chǔ)藏過程中橫截面漸漸出現(xiàn)細(xì)紋，儲(chǔ)藏后期與儲(chǔ)藏前期橫截面裂隙比較明顯，其中花色苷含量較高的糧田黑1501和糧田黑1505的橫截面裂隙變化較花色素含量較低的糧田黑1405和糧田黑1301的橫截面裂隙變化小。觀察放大1 000倍掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)藏初期，4種不同品種的黑米淀粉結(jié)構(gòu)多以復(fù)粒方式存在，淀粉分子被緊密的包裹在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中，淀粉顆粒排列緊密，有清晰棱角分明的多面體結(jié)構(gòu)，儲(chǔ)藏過程中，4種黑米均出現(xiàn)不同程度的破損和坑槽，并且復(fù)粒淀粉轉(zhuǎn)換為松散的單粒淀粉，出現(xiàn)明顯的間隙和空洞，并且儲(chǔ)藏后期可以觀察到部分顆粒黏連在一起。從圖2中可以觀察到花色苷含量較高的糧田黑1501和糧田黑1505的淀粉顆粒黏連程度較花色素含量較低的糧田黑1405和糧田黑1301的程度低。觀察放大5 000倍掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)，原始樣品中的淀粉單體較多，淀粉顆粒形狀均不光滑平坦的，呈現(xiàn)多面體的結(jié)構(gòu)，且多排列整齊有序地裸露在外，而儲(chǔ)藏210 d后的樣品淀粉顆粒形狀粗糙，相當(dāng)一部分單淀粉粒形狀近圓型，棱角較鈍，還有一部分淀粉顆粒變得模糊不清，排列不規(guī)則，且淀粉顆粒多以復(fù)粒形式存在，被膜包裹度高。其中花色苷含量較高的糧田黑1501和糧田黑1505在儲(chǔ)藏前后淀粉顆粒形態(tài)的變化較花色素含量較低的糧田黑1405和糧田黑1301的淀粉顆粒形態(tài)變化小。

圖2 黑米儲(chǔ)藏過程中胚乳細(xì)胞形態(tài)特征掃描電鏡圖

2.3 黑米儲(chǔ)藏過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是黑米品質(zhì)變化的一個(gè)重要的參考性指標(biāo)，目前廣泛應(yīng)用于分析谷物儲(chǔ)藏過程中品質(zhì)的變化，常見蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有 α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)。由圖3可見，蛋白質(zhì)中的酰胺Ⅰ帶在紅外光譜區(qū)有若干明顯的吸收帶，傅里葉變換紅外光譜就是通過檢測(cè)酰胺Ⅰ帶對(duì)紅外輻射的吸收頻率來分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[14]。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：α-螺旋的子峰為1 650～1 658 cm-1，β-折疊為

1 610～1 640 cm-1，β-轉(zhuǎn)角為1 660～1 700 cm-1，無規(guī)則卷曲為1 640～1 650 cm-1。

不同品種的黑米在不同的儲(chǔ)藏時(shí)期，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量不同，具體的含量變化見圖3。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，4種黑米的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，黑米的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序狀向無序態(tài)轉(zhuǎn)變。其中，對(duì)于α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)而言，糧田黑1405下降程度最大，分別由20.89%下降至5.00%，32.35%下降至20.40%；對(duì)于后者兩個(gè)結(jié)構(gòu)而言，糧田黑1405結(jié)構(gòu)含量增加程度也最大，β-轉(zhuǎn)角含量由22.75%增至31.00%，無規(guī)卷曲含量由10.00%增至19.00%。與花色苷含量高的糧田黑1501和糧田黑1505相比，花色素含量低的糧田黑1405和糧田黑1301的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化更為劇烈，造成該現(xiàn)象的原因可能是由于花色苷含量較高的黑米可以有效地清除由于酶促反應(yīng)以及氧化等產(chǎn)生的自由基的物質(zhì)，進(jìn)而能夠有效地阻止脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的進(jìn)一步氧化，進(jìn)而降低黑米蛋白氧化程度，從而顯著影響黑米蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。蔡勇建等[15]對(duì)儲(chǔ)藏過程中米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的研究發(fā)現(xiàn)，米糠氨基酸殘基的氧化以及米糠酸敗產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物會(huì)使米糠蛋白解螺旋和去折疊，會(huì)引起米糠蛋白α-螺旋和β-折疊含量下降，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量增加，最終導(dǎo)致米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序態(tài)向無序態(tài)轉(zhuǎn)變。

圖3 黑米儲(chǔ)藏過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化圖

3 結(jié)論

對(duì)4種黑米的花色苷進(jìn)行鑒定和分析，研究了4種黑米儲(chǔ)藏過程中微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明4種黑米的液相圖基本一致，共出現(xiàn)3個(gè)峰，分別鑒定出是芍藥素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-葡萄糖苷。

定量分析結(jié)果表明，4種黑米中的芍藥素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量綜合在儲(chǔ)藏前后大體呈下降趨勢(shì)，其中就芍藥素-3-O-葡萄糖苷而言，糧田黑1501儲(chǔ)藏前期前后的整體下降率為11.39 μg/g；糧田黑1505整體下降率為18.75%。此外，糧田黑1501和1505在儲(chǔ)藏前后的變化程度較糧田黑1405和1301的變化程度更大。4種黑米儲(chǔ)藏過程中整體和內(nèi)部淀粉顆粒結(jié)構(gòu)均隨著儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)生了明顯的變化。其中糧田黑1405和糧田黑1301 的變化較為顯著，有更清晰棱角的多面體結(jié)構(gòu)的單淀粉粒形狀逐漸近圓型，而糧田黑1501和糧田黑1505控制劣變的程度相對(duì)較強(qiáng)。

隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，4種黑米蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序狀向無序態(tài)轉(zhuǎn)變，其α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。其中，對(duì)于前兩者結(jié)構(gòu)而言，糧田黑1405下降程度最大，分別由20.89%下降至5.00%，32.35%下降至20.40%；對(duì)于后者兩個(gè)結(jié)構(gòu)而言，糧田黑1405結(jié)構(gòu)含量增加程度也最大，β-轉(zhuǎn)角含量由22.75%增至31.00%，無規(guī)卷曲含量由10.00%增至19.00%。