陳 俊 方遠鵬 杜巧麗 蔣君梅任明見 李向陽 田山君 謝 鑫,

(貴州大學農學院農業(yè)微生物特色重點實驗室1，貴陽 550025)(國家小麥改良中心貴州分中心2，貴陽 550025)(貴州大學綠色農藥與農業(yè)生物工程教育部重點實驗室3，貴陽 550025)

高粱(Sorghumbicolor)是我國主要的雜糧作物之一，屬于C4植物，具有光合作用效率高、抗旱性強等特點[1-3]。同時，高粱作為白酒原材料具有重要的經濟價值。白酒是貴州省重要的支柱產業(yè)，白酒行業(yè)的發(fā)展帶動了貴州省的高粱種植，其種植面積在貴州省逐年擴大，使得高粱連作現象較為普遍，由于病原的初始菌量積累和氣候變化等因素，致使其病害危害程度逐年上升，病害危害面積逐年擴大。

病原菌侵染植物時會觸發(fā)植物體內一系列的抗病反應[4]，即誘導植物防御體系激發(fā)抗病基因的表達來應對病原菌的侵入。而過敏性誘導反應是眾多植物抗病反應中最為常見的類型，常表現為病原菌侵染點附近的細胞組織壞死，阻止病菌的擴展和生長，誘發(fā)植物抗病反應[5]。過敏性誘導反應(Hypersensitive-induced reaction，HIR)基因家族是一類與植物HR相聯系的基因家族，隸屬PID(proliferation, ion and death，PID)家族，含有SPFH (stomatins, prohibitins, flotillins and HflK/C) 結構域[6,7]。Karrer等[8]最早在煙草中發(fā)現一種能夠誘導β-葡萄糖苷酶的表達及植物葉片細胞壞死的蛋白NG1。隨后，在玉米、大麥、水稻和辣椒等植物中HIR基因相繼被報道[9-12]。HIR基因家族成員在植物抗病反應中承擔著重要的角色。研究表明，CaHIR1基因是過敏性細胞壞死的正向調控因子，并且能夠參與滲透脅迫的反應[13]。同時，HIR基因也能夠參與單子葉和雙子葉植物的抗病功能和HR反應[7]。目前，HIR基因家族在多種經濟作物上已有研究，但在旱糧作物高粱上的影響鮮有報道。

本研究在全基因組的水平上對高粱HIR基因家族成員進行鑒定，并分析其成員的基本理化性質、染色體定位、基因結構、系統進化關系、以及所編碼蛋白的二級結構進行分析。同時，利用qRT-PCR技術分析高粱HIR基因家族成員的組織特異性，脫落酸(Abscisic acid，ABA)、赤霉素(Gibberellin A3，GA3)和flg22脅迫時對其表達量的影響，以期為進一步挖掘高粱HIR基因家族成員在植物信號通路、調控植物HR反應等方面的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

高粱品種：BTx623。脫落酸；赤霉素；flg22；SYBR熒光染料試劑盒；TRIzol；反轉錄試劑盒。

CFX96TMoptics module實時熒光定量分析儀，NanoDrop one微量核酸蛋白濃度測定儀，Centrifuge 5427 R低溫離心機。

引物采用Primer Premier 5軟件和qPrimerDB數據庫相結合進行設計，選用SbEIF4a作為高粱的內參基因，引物序列如表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 高粱HIR基因家族鑒定、染色體定位和理化性質分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載擬南芥、水稻、玉米、大麥、小麥和辣椒HIR家族成員的氨基酸序列，運用Hmmer程序建立模型，檢索高粱數據庫，選取E值小于0.05的高粱基因序列；結合NCBI-CD結構域數據庫進一步驗證E值小于0.05的高粱基因序列的結構域；在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)數據庫中查詢高粱第2、3、7、9和10號染色體的全長，及高粱HIR家族成員所在染色體數和位置區(qū)間；利用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線網站繪制高粱HIR基因家族染色體分布情況；利用在線網站ExPASy-Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析高粱HIR家族成員的基本理化性質[3]；使用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線網站預測高粱HIR家族成員的亞細胞定位。

1.2.2 高粱HIR家族成員系統發(fā)育分析

為研究高粱HIR家族成員的進化模式，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中下載擬南芥、水稻、玉米、大麥、小麥和辣椒的HIR蛋白序列；利用MEGA7.0，以鄰接法，bootstrap值設置為1 000[14]，構建高粱與這些物種的系統進化樹；利用Figtree軟件對系統發(fā)育樹進行美化。

1.2.3HIR家族基因密碼子偏好分析

利用在線工具Chips(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/chips)和Cusp(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cusp)在線網站分析擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱家族基因密碼子的偏好性。

1.2.4 高粱HIR家族基因結構和HIR家族成員保守基序分析

研究高粱HIR家族基因結構分布情況，及擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR家族成員的功能完整性，對高粱HIR家族基因結構、保守基序(Conserved motif，Motif)進行分析。使用GSDS2(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具對高粱HIR家族基因結構進行分析；利用MEME(http://meme-suite.org/)在線網站(參數：篩選數量為10，E-value

1.2.5 高粱HIR蛋白二級結構分析

使用在線網站NPSA-PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)，對高粱HIR蛋白二級結構組成進行預測。

1.2.6 高粱種植和樣品處理

選擇健康高粱種子在清水中浸種24 h，隨后用濾紙保濕48 h進行催芽，將發(fā)芽的種子播種在滅菌營養(yǎng)土中，在25 ℃、光照12 h/黑暗12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到3葉期，取高粱幼苗的根、莖、葉，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；另一方面將高粱幼苗的根部浸泡在分別含有ABA、GA3和flg22的營養(yǎng)液中，其處理濃度分別為200 μmol/L、100 μmol/L、100 nmol/L，然后分別在處理后0、0.5、1、3、6、9、12、24 h取樣，設置3個生物學重復，每個生物學重復處理5株，所取樣品用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 高粱HIR基因表達分析

采用qRT-PCR技術進行分析，利用qRT-PCR檢測高粱SbHIR1～SbHIR5基因的表達量，其反應體系為：cDNA 4.5 μL，SYBR Premix 7.5 μL，SbHIRs基因的上下游引物各 0.3 μL，ddH2O補足15 μL；反應程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，1個循環(huán)；設置 3 個技術性重復，其數據使用2-ΔΔCt方法進行分析，利用DPS軟件進行顯著性分析，其qRT-PCR引物如表1。

2 結果與分析

2.1 高粱HIR基因家族的鑒定和基本理化性質分析

為研究HIR家族基因在高粱中所存在的成員數，利用Hmmer軟件進行篩選。由表2和圖1可知，在高粱中鑒定出5個HIR基因，根據所在高粱染色體中的位置命名為SbHIR1～SbHIR5；分別處于第2、3、7、9、10號染色體上；SbHIR1、SbHIR2、SbHIR4和SbHIR5基因所編碼的氨基酸數量、相對分子質量大小和理論等電點較為接近，而SbHIR3與其他家族成員的氨基酸序列長度和蛋白分子量大小差異較大分別為413 aa、45.02 ku；高粱HIR家族蛋白均為親水性蛋白；亞細胞定位預測顯示均定位于線粒體中。

圖1 高粱HIR基因在染色體上的分布

表2 SbHIRs基因編碼蛋白的基本特征

2.2 高粱HIR家族系統發(fā)育分析

構建擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱的HIR家族成員系統進化樹。由圖2可知，該進化樹一級分支分為兩支，在二級樹分支內雙子葉植物(擬南芥、辣椒)HIR家族成員明顯區(qū)分于其他幾種單子葉植物(水稻、玉米、小麥、大麥和高粱)，早熟禾亞科(小麥、大麥)、稻亞科(水稻)和黍亞科(高粱、玉米)的HIR成員明顯分開，各自在不同的分支中，而早熟禾亞科與黍亞科HIR成員形成姐妹基因對；相對特殊的是，在同一支內，SbHIR2明顯與其他單子葉HIR成員形成較大的差異(支持率為100%)，單獨形成一個特有支；高粱HIR成員與玉米HIR家族成員的親緣關系較近。

圖2 擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR成員的系統進化分析

2.3 HIR家族基因密碼子偏好分析

由表3可知，不同物種間及物種內HIR基因的密碼子選擇性較為保守，有效密碼子數在33.243～58.430之間，而SbHIR2的有效密碼子數僅為33.243，說明密碼子偏好較強；單子葉植物(水稻、玉米、小麥、大麥和高粱)大部分HIR基因GC和GC3s的含量大于50.00%，即水稻、玉米、小麥、大麥和高粱的HIR基因編碼區(qū)對堿基的選擇更偏向于G+C，且密碼子偏好于以G/C結尾，且該情況在高粱SbHIR2上較為明顯。而雙子葉植物(擬南芥、辣椒)HIR基因GC和GC3s的含量均小于50.00%，對堿基G+C和密碼子G/C結尾的偏好性較弱。不同物種間及物種內HIR基因的有效密碼字數相對保守，單子葉和雙子葉植物HIR基因的堿基偏好及密碼子的結尾的偏好有所不同。

表3 擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR基因的密碼子偏好分析

2.4 高粱HIR家族基因結構和HIR家族蛋白的Motif分析

由圖3a可知，高粱HIR基因內含子數為1～6個，基因結構相對簡單，僅有SbHIR3基因缺乏上游UTR。由圖3b可知，擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱的HIR基因Motif均相對保守，具備9個Motif(OsHIR2和SbHIR2除外)，而OsHIR2和SbHIR2均出現Motif 8的缺失，同時，SbHIR2也缺失Motif 5。

2.5 高粱HIR蛋白二級結構分析

由表4可知，SbHIR1～SbHIR5二級結構均以α-螺旋為主，其次是無規(guī)卷曲、延伸鏈，β-轉角占比最低。

表4 高粱HIR蛋白二級結構組份

2.6 高粱HIR基因表達分析

研究高粱HIR基因家族的組織特異性表達和在植物激素(ABA和GA3)和flg22脅迫處理下的表達量。通過qRT-PCR分析可知，SbHIR1基因在莖中的表達量約為根和葉的4倍；SbHIR2基因在根、莖、葉中均有表達，但在根中表達量最高；SbHIR3、SbHIR4和SbHIR5基因均在葉中表達量最高(圖4)。

圖4 高粱HIR基因家族成員組織表達分析

在植物激素ABA處理后，高粱HIR基因家族各個成員的表達模式不同，SbHIR1和SbHIR5的表達量在12 h時達到最高；SbHIR2和SbHIR3基因在0.5 h時表達量最高，隨后表達量降低；SbHIR4基因在6 h時表達量最高(圖5)。

在植物激素GA3處理下，高粱SbHIR1基因的表達量呈先降后升的趨勢，在3 h時表達量最低，然后又逐漸上升，在12 h時表達量達到最高；SbHIR2和SbHIR3基因在GA3處理下，其表達均受到一定程度的抑制；SbHIR4和SbHIR5基因在GA3處理下均在6 h時表達量達到最高(圖6)。

注： Motif 1～9分別用數字1～9表示。圖3 高粱HIR的基因結構和擬南芥、水稻、玉米、小麥、大麥、辣椒和高粱HIR蛋白保守基序分析

圖5高粱HIR基因家族成員ABA處理的表達分析

圖6高粱HIR基因家族成員GA3處理的表達分析

在flg22脅迫處理下，SbHIR1的表達量呈現出下降-上升-下降-上升的趨勢，在9 h達到最高；SbHIR2和SbHIR4，均在12 h時表達量達到最高；而SbHIR3在各時間段內表達量均有一定程度的變化，但12 h時表達量最低；SbHIR5的表達量呈現出下降-上升-下降的趨勢，在9 h達到最高(圖7)。

圖7高粱HIR基因家族成員flg22處理的表達分析

3 結論

利用生物信息學方法和qRT-PCR技術在全基因組水平上對高粱HIR基因家族進行鑒定，共鑒定得到5個成員；5個成員之間的理化性質具有差異，且均為親水性蛋白；系統進化分析發(fā)現高粱HIR基因與玉米的親緣關系較近；密碼子偏好分析表明，高粱的HIR基因編碼區(qū)對堿基的選擇更偏向于G+C，且密碼子偏好于以G/C結尾；高粱HIR基因家族成員的二級結構均以α-螺旋為主；高粱HIR基因家族成員在根、莖和葉中均能夠表達，且在植物激素(ABA和GA3)的處理下，其在高粱葉片中的表達量均出現了不同程度的變化，當flg22脅迫處理時其高粱HIR基因家族成員的表達量變化趨勢較為明顯。