李歡康，楊佳瑋，劉文玉，魏長慶

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

核桃，又稱胡桃、羌桃，是胡桃科植物，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”，是我國重要經(jīng)濟(jì)樹種之一。核桃仁含油65%～70%，并含有大量的多不飽和脂肪酸（61.8%～75.3%），其中含亞油酸62.2%、亞麻酸13.5%，同時(shí)還含有多種維生素及礦物元素，具有細(xì)胞修復(fù)、消炎、抗病毒、抗血栓等功效，宜長期食用[1-2]。

氣味是植物油風(fēng)味的典型特征之一，是判斷植物油的品質(zhì)及質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。油脂揮發(fā)性物質(zhì)是其氣味產(chǎn)生的基礎(chǔ)物質(zhì)，其形成與制備工藝有著密切關(guān)聯(lián)[3]。核桃油常見制備方法主要包括壓榨法、有機(jī)溶劑浸提法、水酶法和超臨界萃取法[4]等，本實(shí)驗(yàn)選擇適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的壓榨法和有機(jī)溶劑浸提法進(jìn)行研究，其中壓榨法是當(dāng)前生產(chǎn)核桃油的主要方法[5]，包括冷榨法和熱榨法，該方法是利用機(jī)械壓榨的方式將核桃仁中的油脂通過螺桿擠壓擠出，冷榨核桃油的品質(zhì)較高，營養(yǎng)成分保留較好，但是氣味清淡，熱榨核桃油具有典型的烘烤堅(jiān)果味，氣味濃郁，但是在高溫烘烤過程中會造成部分營養(yǎng)成分的損失；有機(jī)溶劑浸提法是利用萃取原理，選用某種能溶解油脂的有機(jī)溶劑，經(jīng)與適度破碎核桃仁的接觸（浸泡或噴淋），使核桃仁中的油脂被有機(jī)溶劑萃取出來的一種方式，該方法提取率較高，適合大規(guī)模生產(chǎn)，但可能存在一定的溶劑殘留，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[6]，且風(fēng)味較差，缺乏核桃油本身獨(dú)特的風(fēng)味。目前已有研究表明[7-13]，不同工藝制備核桃油的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成存在不同，但是，仍鮮見基于揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成對不同工藝制備的核桃油進(jìn)行區(qū)分的相關(guān)報(bào)道，而利用揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成差異可為核桃油制備工藝的區(qū)分判別提供參考。

食用油的風(fēng)味物質(zhì)分析通常先采用蒸餾法、頂空法、吸附法等技術(shù)對風(fēng)味組分進(jìn)行提取富集，然后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析檢測[14]，其中靜態(tài)頂空分析法是將食用油置于密閉容器中加熱，待食用油與上層空氣達(dá)到熱力學(xué)平衡后，直接取頂空氣體進(jìn)樣，此法制備簡便，不使用溶劑，不混入干擾物，進(jìn)樣的氣體與人能嗅到的香氣近似[15]。

本研究通過冷榨、熱榨（不同烘烤溫度和時(shí)間）、有機(jī)溶劑浸提法（索氏抽提法）制備核桃油，對不同樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)測定，利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)合相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類熱圖，對不同制備工藝核桃油樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，以期確定不同工藝制備核桃油的關(guān)鍵香氣成分，并探索基于揮發(fā)性物質(zhì)對不同工藝核桃油進(jìn)行有效區(qū)分的可行性，為核桃油生產(chǎn)加工及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃購于新疆維吾爾自治區(qū)石河子市農(nóng)貿(mào)市場，品種為溫185。正己烷（分析純） 德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B/5977A頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；ZY-22A螺桿榨油機(jī) 中國溫州宏闊科技有限公司；K1H烤箱 中國廣東格蘭仕電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷榨核桃油的制備

將300 g核桃仁置于螺桿榨油機(jī)中，調(diào)節(jié)溫度為30 ℃，壓榨得到毛油，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上層清液得到冷榨核桃油樣品[16]。

1.3.2 熱榨核桃油的制備

各取300 g核桃仁于120、150 ℃和180 ℃分別烘烤10、20 min和30 min[17]，取烘烤后的核桃仁迅速冷卻至室溫，置于螺桿榨油機(jī)中，調(diào)節(jié)溫度為30 ℃，壓榨得到毛油，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上層清液得到熱榨核桃油樣品。

1.3.3 有機(jī)溶劑浸提核桃油的制備

采用索氏抽提法[18]，提前將核桃仁粉碎，選用正己烷作為有機(jī)溶劑萃取，于70 ℃回流提取4 h，后經(jīng)70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收正己烷，剩余即為有機(jī)溶劑提取樣品。

1.3.4 頂空條件

加熱箱80 ℃，時(shí)間30 min；進(jìn)樣時(shí)間30 s，進(jìn)樣量1 μL；傳輸線溫度100 ℃；定量環(huán)溫度105 ℃。

1.3.5 色譜條件

根據(jù)Tahri等[19]方法進(jìn)行修改。

HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；溶劑延遲1.5 min；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持3 min；以2 ℃/min升至80 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升至150 ℃，保持4 min；以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；載氣（高純度He）流速1.0 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；傳輸線溫度230 ℃。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；四極桿溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；全掃描模式；溶劑延遲3 min；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。

1.3.7 化合物識別

化合物經(jīng)過NIST譜庫檢索定性分析，僅報(bào)道匹配度大于80%的化合物，同時(shí)以各化合物峰面積占總峰面積的比值表示化合物的相對含量。

1.3.8 ROAV計(jì)算

通過計(jì)算ROAV[20]，確定揮發(fā)性物質(zhì)對樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)。一般認(rèn)為ROAV＞1的揮發(fā)性物質(zhì)是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，0.1＜ROAV≤1的揮發(fā)性物質(zhì)是對樣品的總體風(fēng)味起修飾作用。選取化合物中對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的ROAVstan為100，其余各組分的ROAV按下式計(jì)算：

式中：CA為各組分的相對含量/%；TA為各組分的感覺閾值/（mg/kg）；Cstan為對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的化合物的相對含量/%；Tstan為對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的化合物的感覺閾值/（mg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018 Pro、SPSS Statistics 25.0、The Unscrambler 9.7以及MeV 4.90處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝制備核桃油揮發(fā)性成分分析

使用頂空氣相色譜-質(zhì)譜對不同工藝核桃油揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測定分析，此方法樣品制備簡單，不使用溶劑，不存在交叉污染等問題[21-22]。如圖1、表1所示，不同工藝核桃油中共檢測到92 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括29 種醛類、21 種烴類、11 種醇類、8 種酮類、7 種酯類、5 種酸類、4 種含氧雜環(huán)、2 種含氮雜環(huán)及5 種其他化合物。其中有機(jī)溶劑浸提核桃油測得60 種揮發(fā)性物質(zhì)，冷榨樣品測得43 種揮發(fā)性物質(zhì)，熱榨樣品測得62 種揮發(fā)性物質(zhì)，所有樣品共有化合物有14 種。對于冷榨和熱榨核桃油樣品，揮發(fā)性物質(zhì)含量最高的是反-2-庚烯醛，其次為正己醛和順-2-辛烯；對于有機(jī)溶劑浸提得到的核桃油樣品，揮發(fā)性物質(zhì)含量最高的為正己醛，其次為反-2-庚烯醛和戊醛。

表1 不同工藝制備核桃油揮發(fā)性物質(zhì)組成及相對含量Table 1 Composition and contents of volatile substances in walnut oil prepared by different processes

續(xù)表1

圖1 不同工藝制備核桃油總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of volatile substances in walnut oil prepared by different processes

由以上分析可知，不同制備工藝所得核桃油樣品的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成存在顯著差異（P＜0.05），有機(jī)溶劑浸提法所得樣品與壓榨法的揮發(fā)性物質(zhì)存在一定差異性，由于溶劑熱萃取的作用以及萃取過程對脂肪酸有更大的分解作用[25]，部分揮發(fā)性物質(zhì)只在有機(jī)溶劑浸提樣品中檢測到，包括反,反-2,4-壬二烯醛、戊醛、異戊醇、正辛醇、1-辛烯-3-酮、2,5-己二酮、3-壬烯-2-酮、1,2-二甲基丁炔酯、丙位己內(nèi)酯、2-庚烯酸、辛酸、3-甲基-2-己烯、反-2,2-二甲基-3-己烯等，但是由于這些物質(zhì)感覺閾值較高，含量較低，因此對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

如圖2所示，核桃油樣品中醛類占比最高，為61.57%～82.67%，其次為烴類（3.88%～35.47%）、醇類（0.26%～9.83%）、含氧雜環(huán)（0.61%～4.04%），其余幾類物質(zhì)含量占比較低，其中有機(jī)溶劑浸提樣品中的醛類物質(zhì)占比最高，烴類物質(zhì)占比最低。

圖2 不同工藝制備核桃油揮發(fā)性物質(zhì)占比Fig. 2 Proportions of volatile substances in walnut oil prepared by different processes

醛類物質(zhì)中，有機(jī)溶劑浸提核桃油中相對含量最高的為正己醛（35.78%），其次為反-2-庚烯醛（13.46%）；冷榨核桃油和熱榨核桃油中相對含量最高的是反-2-庚烯醛（21.00%～28.61%），其次為正己醛（15.09%～20.72%）。醛類物質(zhì)主要來自于脂質(zhì)分子的自由基的裂解。脂質(zhì)自動氧化生成的過氧化物在超過150 ℃時(shí)易分解，生成烷氧基自由基和羥自由基，烷氧基自由基進(jìn)一步裂解形成揮發(fā)性的醛、烯和醇等有機(jī)化合物[26]。醛類物質(zhì)具有清香、果香、脂肪香等香氣特征，其檢出濃度較高且香氣閾值較低，是核桃油的主要呈香物質(zhì)。

烴類物質(zhì)中，有機(jī)溶劑浸提核桃油中相對含量最高的為3-異丙基-1-環(huán)己烯（1.28%），其次為1-辛烯（1.06%）；冷榨核桃油中相對含量最高的是順-2-辛烯（13.56%），其次為順-3-辛烯（8.93%）；120 ℃/10 min熱榨核桃油中相對含量最高的是順-3-辛烯（12.12%），其次為環(huán)辛烷（5.41%），其余熱榨核桃油中相對含量最高的是順-2-辛烯（9.77%～16.28%），其次為順-3-辛烯（5.81%～9.78%）。烴類物質(zhì)在所有樣品中均有檢出，包括飽和烴和不飽和烴，不飽和烴閾值較低，飽和烴閾值較高，主要來自于脂肪酸烷氧基的裂解，對風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[27]。

醇類物質(zhì)中，有機(jī)溶劑浸提核桃油中相對含量最高的為異戊醇（2.21%），其次為1-辛烯-3-醇（0.90%）；冷榨核桃油和熱榨核桃油中主要揮發(fā)性物質(zhì)為4-甲基環(huán)己醇（5.83%～9.36%）、反-2-壬烯-1-醇（0.05%～0.33%）、順-3-辛烯-1-醇（0.10%～0.29%）和1-辛烯-3-醇（0.05%～0.15%）。飽和醇類閾值較高，高濃度下才會對核桃油風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用。不飽和醇類閾值相對較低，對核桃油風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)作用[28]，如1-辛烯-3-醇。

2-戊基呋喃是核桃油揮發(fā)性物質(zhì)含氧雜環(huán)中相對含量最高的物質(zhì)，為0.56%～4.04%，一般為碳水化合物或不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生[29]，表現(xiàn)為綠豆、黃油味，但其含量較低，對核桃油風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

2.2 不同工藝核桃油關(guān)鍵香氣成分分析

核桃油的總體風(fēng)味是由其揮發(fā)性成分的相對含量及感覺閾值共同決定的。只有部分化合物對核桃油總體風(fēng)味起到顯著貢獻(xiàn)，這些化合物即為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。在衡量揮發(fā)性物質(zhì)對風(fēng)味的貢獻(xiàn)時(shí)，僅以物質(zhì)的相對含量進(jìn)行判斷不夠全面和準(zhǔn)確。研究樣品往往包含幾十甚至上百種揮發(fā)性化合物，氣味活度值的絕對定量非常繁瑣且成本較高，因此為進(jìn)一步分析各揮發(fā)性物質(zhì)對核桃油風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，采用計(jì)算ROAV進(jìn)行分析[30-31]。

根據(jù)文獻(xiàn)查閱得到的感覺閾值計(jì)算出核桃油揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成中ROAV大于0.1的揮發(fā)性物質(zhì)[23-24]，結(jié)果如表2所示，其中反,反-2,4-癸二烯醛是核桃油中風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)。在有機(jī)溶劑浸提樣品中，反,反-2,4-癸二烯醛、反式-2-壬醛、反,反-2,4-壬二烯醛、1-辛烯-3-醇和壬醛是關(guān)鍵香氣成分；在冷榨樣品、120 ℃/10 min樣品、150 ℃/10 min樣品、150 ℃/30 min樣品中，反,反-2,4-癸二烯醛和2-丁烯醛是關(guān)鍵香氣成分；在120 ℃/20 min樣品、120 ℃/20 min樣品、180 ℃/10 min樣品和180 ℃/20 min樣品中，反,反-2,4-癸二烯醛是關(guān)鍵香氣成分；在150 ℃/20 min樣品、180 ℃/30 min樣品中，反,反-2,4-癸二烯醛、2-丁烯醛和反,反-2,4-壬二烯醛是關(guān)鍵香氣成分，其余物質(zhì)對核桃油的風(fēng)味起修飾作用。王勇[32]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)合ROAV法對市售核桃油的香氣成分進(jìn)行了分析，測出9 種關(guān)鍵揮發(fā)性香氣成分，分別為反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、己醛、壬醛、2-辛烯醛、辛醛、反-2-癸烯醛、反-2-庚烯醛、2-戊基呋喃，與本研究結(jié)果相似。何金鑫[33]利用ROAV法計(jì)算分析出了山核桃的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，包括己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2-壬烯醛、2-癸烯醛，與本研究結(jié)果有所差異的原因可能是核桃的品種不一致，以及在制油過程中部分揮發(fā)性物質(zhì)未進(jìn)入油相，殘留在核桃蛋白粕里。

表2 不同工藝制備核桃油揮發(fā)性物質(zhì)的ROAVTable 2 ROAV values of volatile substances in walnut oil prepared by different processes

2.3 不同工藝核桃油關(guān)鍵香氣成分PCA

PCA是采取降維的方法，找出對樣品貢獻(xiàn)最大和最主要的因子，利用PCA空間分布圖可以在最大程度上體現(xiàn)因子間的差異性[35]。對表2中的17 種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA，如圖3所示。共提取到2 個(gè)PC，PC1（66%）和PC2（29%），累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95%（大于85%），可以較好反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，完全符合PCA要求[36]。

圖3 PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 3 PCA scores (A) and correlation loadings (B) plots

圖3A結(jié)果表明，正己醛（2）、2-己烯醛（3）、2-辛烯醛（6）、壬醛（7）、反-2-壬醛（8）、1-辛烯-3-醇（13）、正己酸（14）和2-戊基呋喃（15）與PC1顯示出較強(qiáng)的正相關(guān)，2-丁烯醛（1）與PC1顯示出較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；PC2與2-丁烯醛（1）、反,反-2,4-壬二烯醛（12）顯示出較強(qiáng)的正相關(guān)，與反,反-2,4-癸二烯醛（9）顯示出較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。結(jié)合ROAV可得，壬醛（7）、反-2-壬醛（8）、反,反-2,4-癸二烯醛（9）和1-辛烯-3-醇（12）為核桃油中的關(guān)鍵香氣成分。壬醛為油脂、柑橘和青草味，反-2-壬醛為黃瓜、油脂和青草味，反,反-2,4-癸二烯醛為油炸、蠟、油脂味，1-辛烯-3-醇為蘑菇味，共同構(gòu)成了核桃油的整體風(fēng)味。Mu Honglei等[37]研究了氧化過程中的核桃油揮發(fā)性物質(zhì)，PCA結(jié)果顯示2-辛烯醛、己醛、2-庚醛、1-辛烯-3-醇、己酸和壬醛是主要的風(fēng)味物質(zhì)，與本研究相似，均分析認(rèn)為1-辛烯-3-醇和壬醛是核桃油中的關(guān)鍵香氣成分。

圖3B可以很明顯區(qū)分不同工藝核桃油樣品。樣品A與其他樣品距離較遠(yuǎn)，說明樣品A與其他樣品風(fēng)味具有明顯差異，即可以通過揮發(fā)性物質(zhì)將有機(jī)溶劑浸提所得核桃油與壓榨所得核桃油區(qū)分開。其中150 ℃/10 min樣品（F）、150 ℃/20 min樣品（G）和150 ℃/30 min樣品（H）聚在一起，說明這些樣品的揮發(fā)性成分具有相似性，其余樣品分布無規(guī)律。

2.4 不同工藝核桃油熱圖分析

圖4中每種成分平均值的差值大小用不同顏色深淺表示，顏色越深含量越多，顏色越淺含量越少，最深色為不同樣品間特有成分[38]。從圖4可以看出，有機(jī)溶劑浸提樣品與壓榨所得樣品色差較大，說明2 類樣品揮發(fā)性香氣物質(zhì)差異性明顯。從樣品聚類結(jié)果進(jìn)行分析，主要分為了兩大類，一類是有機(jī)溶劑浸提樣品，另一類是壓榨所得樣品，可得到相同結(jié)論。對于a區(qū)域的揮發(fā)性物質(zhì)來說，有機(jī)溶劑浸提所得樣品的含量均高于壓榨所得樣品。對于b區(qū)域揮發(fā)性物質(zhì)，有機(jī)溶劑浸提所得樣品的含量均小于壓榨所得樣品。對于其他區(qū)域揮發(fā)性物質(zhì)，樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量呈現(xiàn)無規(guī)律變化。因此可通過a和b區(qū)域的化合物對核桃油的制備工藝進(jìn)行區(qū)分。

圖4 揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖Fig. 4 Clustering heat map of volatile substances in walnut oil prepared by different processes

3 結(jié) 論

通過分析不同工藝制備的11 個(gè)核桃油樣品揮發(fā)性香氣物質(zhì)，并通過ROAV和PCA法確定樣品中的關(guān)鍵香氣成分。結(jié)果表明，11 個(gè)核桃油樣品中共鑒定出92 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中有29 種醛類、21 種烴類、11 種醇類、8 種酮類、7 種酯類、5 種酸類、4 種含氧雜環(huán)、2 種含氮雜環(huán)以及5 種其他化合物。不同提取工藝得到的樣品揮發(fā)性香氣物質(zhì)構(gòu)成不同，有機(jī)溶劑浸提法所得樣品與壓榨樣品的揮發(fā)性香氣物質(zhì)存在一定差異，對于壓榨核桃油樣品，包括冷榨和熱榨，揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較高的是反-2-庚烯醛、正己醛和順-2-辛烯；對于有機(jī)溶劑浸提核桃油樣品，揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較高的是正己醛、反-2-庚烯醛和戊醛。結(jié)合ROAV和PCA，確定了壬醛、反-2-壬醛、反,反-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇是核桃油中的關(guān)鍵香氣成分。通過揮發(fā)性成分聚類熱圖分析，不同工藝制備的樣品之間色差較大，表明揮發(fā)性物質(zhì)可作為區(qū)分不同工藝制備核桃油的判別方式。