再努熱?吐爾孫 金欣 郭美琪 李敏 潘麗娜

摘要 為評估辛硫磷對天敵昆蟲白蛾周氏嚙小蜂的安全性，在室內(nèi)條件下，通過藥膜法測定辛硫磷對小蜂的安全性，并檢測亞致死濃度脅迫下，小蜂乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性變化。藥膜法進行毒力分析表明，辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂具有明顯的觸殺毒性，屬高風險性農(nóng)藥。亞致死濃度辛硫磷即可明顯抑制小蜂乙酰膽堿酯酶活性，同時提高其羧酸酯酶與GST酶活性。辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂毒性極高，在生物防治區(qū)域需慎用。

關(guān)鍵詞 白蛾周氏嚙小蜂;辛硫磷;乙酰膽堿酯酶;羧酸酯酶;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號 Q 965.9;S 43? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）16-0162-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.043?? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Safety of? Phoxim against Natural Enemy Insect ?Chouioiacunea ?（Yang）

Zainure Tuersun1，2， JIN Xin1，2， GUO Mei-qi1，2 et al

（1. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387;2. Tianjin Key Laboratory of Animal Diversity Protection and Utilization，Tianjin 300387）

Abstract To evaluate the safety of phoxim on ?Chouioiacunea （Yang）， the safety of phoxim to ?C.cunea ?was determined by toxic film method， and the acetylcholine esterase， carboxyesterase and glutathione-S-transferase activities of ?C. cunea ?were detected under the stress of sublethal concentration.The results showed that phoxim had obvious cytotoxicity to ?C. cunea ， which was a high-risk pesticide. The AchEactivity of ?C. cunea ?was inhibited and the CarE and GST activity of ?C. cunea ?was increased at the sublethal concentration. Toxicity of phoxim in ?C. cunea ?was extremely high， and it should be used with caution in biocontrol areas.

Key words ?Chouioiacunea （Yang）; Phoxim;Acetylcholinesterase;Carboxyesterase;Glutathione-S-transferase

美國白蛾（鱗翅目燈蛾科）[ Hyphantriacunea （Drury）]是國際性檢疫害蟲，食性雜、繁殖量大、適應(yīng)性強，自1979年首次在遼寧丹東發(fā)現(xiàn)以來，呈逐步蔓延趨勢，現(xiàn)已擴散至13個省級行政區(qū)，給我國的農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝生產(chǎn)帶來巨大損失[1]。近年來，美國白蛾疫情高發(fā)區(qū)采用“航空施藥為主，地面防治為輔”的綜合防治策略，已取得巨大成效，但施藥方法、施藥劑量、藥劑毒性及藥劑在林間降解慢等帶來一系列的環(huán)境問題、食品安全問題。而以生物防治為主的綜合治理技術(shù)將在保護我國林業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到越來越重要的作用，其中，白蛾周氏嚙小蜂（膜翅目姬小蜂科）[ Chouioiacunea （Yang）]是楊忠岐[2]在美國白蛾蛹中發(fā)現(xiàn)的一種優(yōu)勢寄生蜂，防治效果顯著，寄生率可達92.2%以上。目前，農(nóng)藥對天敵昆蟲的安全性越來越引起人們的重視，但殺蟲劑對白蛾周氏嚙小蜂的風險評價甚少。

辛硫磷（phoxim）是一種高效的有機磷農(nóng)藥，作為一種廣譜殺蟲劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)[3-4]。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，辛硫磷對美國白蛾3齡和5齡幼蟲均表現(xiàn)出較高毒力，LC 50分別為2.39和23.47 mg/L[5]。農(nóng)林生產(chǎn)實踐中，40%辛硫磷乳油稀釋1 000倍噴霧常用于楊樹、桑園等美國白蛾（4齡前）防治工作，殘毒期3～5 d[6-10]。辛硫磷主要抑制乙酰膽堿酯酶的活性，造成乙酰膽堿在突觸后膜的積累而導致害蟲的最終死亡[11]。昆蟲主要從2個方面獲得對有機磷農(nóng)藥的抗藥性：降低乙酰膽堿酯酶（AChE）對有機磷殺蟲劑的敏感性;提高解毒酶如酯酶（esterase，EST）、細胞色素P450單加氧酶（cytochromeP450 monooxygenases）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases）的活性以水解、分離有機磷農(nóng)藥[3]。據(jù)報道，辛硫磷處理可引起家蠶解毒酶相關(guān)基因CYP6AB、CYP306A、CarE2、GST1、GSTd1的轉(zhuǎn)錄水平提高，同時CYP450酶活性、CarE酶活性、GST酶活性均隨時間增加而增強[12]。此外，亞致死劑量辛硫磷處理可提高斑痣懸繭蜂（一種可防治多種鱗翅目害蟲的內(nèi)寄生蜂）GST基因（MpulGSTs）表達水平[13]。

筆者采用藥膜法，通過不同濃度、不同揮發(fā)時間辛硫磷處理檢測其對美國白蛾寄生性天敵周氏嚙小蜂的安全性，并以亞致死濃度辛硫磷脅迫刺激白蛾周氏嚙小蜂，測定其乙酰膽堿酯酶活性及2種主要解毒酶羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，旨在為科學組配、綜合防控美國白蛾提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：白蛾周氏嚙小蜂由漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈，并在天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室內(nèi)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：置于人工氣候箱（PQX-350H）中，溫度25 ℃，相對濕度75%，光周期13L：11D。自接種于柞蠶（ Antheraeapernyi ）（Lepidoptera：Saturniidae）蛹后，培養(yǎng)14 d獲得老熟幼蟲，培養(yǎng)20 d獲得成蟲。

藥劑及儀器：辛硫磷顆粒劑（有效成分含量3%），西安亞森化工有限公司。辛硫磷40%乳油，天津華宇農(nóng)藥有限公司（田間使用濃度200～400 mg/L）。乙酰膽堿酯酶（AchE）活性測定試劑盒（貨號：BC2025）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒（貨號：BC0355）、羧酸酯酶（CarE）活性檢測試劑盒（貨號：BC0840），北京索萊寶科技有限公司。手持式電動組織研磨器，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限責任公司。多功能酶標儀（Infinite 200），瑞士帝肯（Tecan）。

1.2 方法

1.2.1

室內(nèi)毒力評估。將辛硫磷40%乳油分別稀釋至有效濃度0、4、8、12、16、20 mg/L，在50 mL廣口錐形瓶中倒?jié)M藥液，靜置5 min，倒出管內(nèi)藥液，使藥液在管壁上均勻形成藥膜，室內(nèi)通風條件下自然揮發(fā)，分別于1、2和3 d后，接入羽化后12 h內(nèi)的成蜂50頭，瓶口用120目網(wǎng)布封口，分別于1、2、4和6 h后檢查統(tǒng)計瓶中小蜂死亡數(shù)量。評估辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的毒力，并計算辛硫磷使白蛾周氏嚙小蜂死亡10%、20%、30%、50%的劑量（LC 10、LC 20、LC 30、LC 50）。

1.2.2

乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測。根據(jù)室內(nèi)毒力評估數(shù)據(jù)，分別應(yīng)用清水，LC 10、 LC 20、 LC 30、LC 50濃度辛硫磷制備藥膜，自然揮發(fā)2 h，接入羽化后12 h內(nèi)的成蜂200頭，瓶口用120目網(wǎng)布封口;2 h后，取1.5 mL離心管，稱重，加入110只活體小蜂，再次稱重，計算出小蜂重量，按照每0.01 g小蜂加入100 μL提取液，加入提取液（約150 μL）;冰浴勻漿后，15 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)至新離心管待測（冰上放置）;分別依據(jù)試劑盒說明書操作并計算酶活。

1.2.3

辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的安全性等級。農(nóng)藥對白蛾周氏嚙小蜂的毒性評價目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標準，根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》（GB##—2004），可用安全系數(shù)評價農(nóng)藥使用對赤眼蜂（膜翅目，卵寄生蜂）的安全性：極高風險性（安全系數(shù)≤0.05）;高風險性（0.05<安全系數(shù)≤0.5）;中風險性（0.5<安全系數(shù)≤5）;低風險性（安全系數(shù)>5）。白蛾周氏嚙小蜂與赤眼蜂同為寄生性天敵昆蟲，因此其安全性評價可參照赤眼蜂，安全系數(shù)為白蛾周氏嚙小蜂的半致死濃度LC 50與該藥的田間推薦施用濃度的比值，可用下列公式表示：安全系數(shù)=毒性LC 50（mg/L）/田間實際使用濃度（mg/L）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel軟件計算平均值及標準差，采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計，Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗，Probit程序用于計算毒力回歸方程、LC 50及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的毒性評估

為檢測錯時施藥與放蜂過程中，辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的安全性，在室內(nèi)通風條件下讓藥物自然揮發(fā)，分別于1、2和3 d后，接入小蜂，并評估辛硫磷對小蜂的毒力。由表1可知，隨著藥物濃度的提高，辛硫磷對小蜂的毒殺作用增強，但藥物揮發(fā)2～3 d后，其對小蜂的毒殺作用明顯降低。觸殺毒力分析表明，藥物揮發(fā)1～2 d后接入小蜂2 h后，依據(jù)田間使用濃度200 mg/L計算，其安全系數(shù)均小于0.05，為極高風險性農(nóng)藥;藥物揮發(fā)3 d后接入小蜂2 h后，其安全系數(shù)為0.079，仍屬于高風險性農(nóng)藥（表2）。說明田間常用有機磷農(nóng)藥辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂有極高風險，即使施藥3 d后放蜂，對小蜂仍有極高毒性，不推薦在生物防治區(qū)域使用。

2.2 辛硫磷脅迫對白蛾周氏嚙小蜂AchE活性的影響

辛硫磷作為一種有機磷殺蟲劑，是絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，對乙酰膽堿酯酶（AchE）具有強烈抑制作用，造成乙酰膽堿在突觸后膜的累積，引起神經(jīng)興奮異常，導致蟲體振顫、痙攣并最終死亡[11]。LC 10濃度（依據(jù)表2，施藥后2 h，使小蜂死亡10%的藥物劑量）辛硫磷脅迫即可引起小蜂乙酰膽堿酯酶活性降至對照的20%以下（圖1），說明白蛾周氏嚙小蜂對辛硫磷的敏感性與其乙酰膽堿酯酶活性受抑密切相關(guān)。

2.3 辛硫磷脅迫對白蛾周氏嚙小蜂GST、CarE活性的影響

為進一步研究辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的毒性機理，應(yīng)用亞致死濃度辛硫磷制備藥膜，檢測小蜂2種解毒酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）及羧酸酯酶（CarE）活性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度（LC 10與LC 20）辛硫磷脅迫處理，小蜂的GST酶活

無明顯變化，僅在辛硫磷脅迫濃度達LC 50時（半致死濃度），GST活性才提升到對照的2.5倍（圖2A）。亞致死濃度辛硫磷刺激可引起CarE活性提高，但LC 10～LC 30濃度辛硫磷脅迫引起CarE活性差異不顯著（圖2B）。說明白蛾周氏嚙小蜂對有機磷農(nóng)藥缺乏抗性，其酯酶與GST酶活性難以有效水解、分離辛硫磷，且其乙酰膽堿酯酶對辛硫磷高度敏感。

3 討論

評價殺蟲劑與特定天敵昆蟲的可配伍性，可為保護天敵的防治決策提供依據(jù)，雖然大部分殺蟲劑均能有效控制害蟲，但對天敵的選擇性不強[14-15]。該研究評估了農(nóng)林生產(chǎn)中常用的有機磷殺蟲劑辛硫磷對天敵昆蟲白蛾周氏嚙小蜂的安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛硫磷對小蜂有較高毒性，即使施藥后自然揮發(fā)1～2 d后，仍對白蛾周氏嚙小蜂有極高風險性。

殺蟲劑對天敵昆蟲的影響不僅是殺死成蟲。當天敵昆蟲受到藥劑脅迫時，可能出現(xiàn)營養(yǎng)、代謝失調(diào)，疾病易感性增強等現(xiàn)象，甚至影響天敵壽命，產(chǎn)卵、發(fā)育及定位寄主等[16-18]。辛硫磷對天敵昆蟲的影響尚鮮見報道，但有證據(jù)表明暴露于亞致死劑量的辛硫磷后，家蠶對陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae ?sp.（ E.cloacae ）的敏感性提高，即容易受到病原體感染[19]。亞致死劑量的辛硫磷通過降低蠶絲腺和神經(jīng)系統(tǒng)的攝食率和消化率，誘導活性氧應(yīng)激（ROS）的產(chǎn)生，從而影響蠶的生長、繁殖和氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]，且辛硫磷會導致家蠶中腸營養(yǎng)代謝的失調(diào)[21]。因此，為進一步全面評估辛硫磷對白蛾周氏嚙小蜂的安全性，以后應(yīng)繼續(xù)研究該藥物對小蜂的亞致死效應(yīng)，如辛硫磷是否影響小蜂定位寄主，是否影響寄生成功率，是否影響發(fā)育歷程及營養(yǎng)代謝、免疫等。

隨著綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展理念日益深入人心，充分發(fā)揮天敵昆蟲自然控害能力，同時減少化學農(nóng)藥對天敵的殺傷作用，是未來農(nóng)林蟲害管理發(fā)展的重要方向。

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