金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌之一，由其引發(fā)的食物中毒事件屢見不鮮，國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)《GB 29921-2013》將其列為食品中最常見的五種致病菌之一，并要求使用平板計(jì)數(shù)法（涂布法）進(jìn)行檢測(cè)。然而實(shí)際工作中往往會(huì)遇到一種情況，當(dāng)樣品中目標(biāo)菌濃度很低而背景菌濃度很高，低稀釋倍數(shù)下其目標(biāo)菌會(huì)被大量的背景菌覆蓋，導(dǎo)致后續(xù)無法挑取目標(biāo)菌菌落，而若提高稀釋倍數(shù)，則無法培養(yǎng)出目標(biāo)菌落。此時(shí)，MPN計(jì)數(shù)法更能夠準(zhǔn)確地反映出此類樣品中金黃色葡萄球菌的污染程度，因?yàn)镸PN體系擁有高數(shù)量的平行管、小于十倍的稀釋倍數(shù)、更適宜的生長(zhǎng)條件以及便于解釋和彌補(bǔ)的重復(fù)誤差。不過，國(guó)標(biāo)中的MPN計(jì)數(shù)法也有其不足之處。第一，劃線分離和挑取可疑菌落的工作量大，劃線分離一個(gè)樣品就需要?jiǎng)?塊BP平板，倘若有可疑菌落，每塊BP平板又需要挑5個(gè)可疑菌落做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，等于一個(gè)樣品最多要做45個(gè)兔血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。第二，僅僅9管的MPN法，其準(zhǔn)確性受到限制。MPN法的準(zhǔn)確性取決于做的管數(shù)，管數(shù)越多，準(zhǔn)確性就越高，但增加管數(shù)也就意味著更多的工作量、更高的檢測(cè)成本，這可能就是“限量標(biāo)準(zhǔn)”中不使用MPN法的原因之一。

本文介紹了一種快速的金黃色葡萄球菌MPN檢測(cè)法（以下簡(jiǎn)稱“快速M(fèi)PN檢測(cè)法”），可以大幅縮短檢測(cè)周期，節(jié)約企業(yè)檢測(cè)成本，還可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

一、材料

7.5%Nacl肉湯，廣東環(huán)凱;1%亞碲酸鉀溶液，青島海博;兔血漿（RPFA）纖維蛋白原瓊脂，Bioker;Baird-Parker（BP）瓊脂，廣東環(huán)凱;凍干兔血漿，廣東環(huán)凱;腦心浸出（BHI）液肉湯，青島海博;96方孔板，2.2ml;金黃色葡萄球菌菌種，CICC 21600。

二、方法

1.快速M(fèi)PN檢測(cè)法操作步驟。（1）檢樣制備。取25g（ml）樣品，放入盛有225ml7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯（每1000ml7.5%氯化鈉肉湯中加入1ml1%亞碲酸鉀溶液）的均質(zhì)袋內(nèi)，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min，混合均勻，制成1︰10的樣品均液。在7.5%氯化鈉肉湯中加入亞碲酸鉀的目的有兩個(gè)，一是亞碲酸鉀可以抑制非葡萄球菌的細(xì)菌生長(zhǎng)，增加增菌時(shí)的選擇性;二是金黃色葡萄球菌能夠還原亞碲酸鉀產(chǎn)生黑色沉淀，方便結(jié)果觀察。（2）稀釋。取1︰10的樣品均液1.0ml，加入7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯9.0ml，渦旋混合均勻，制成1︰100的樣品均液。按此方法制備十倍系列稀釋樣品勻液。（3）加樣。選擇3個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度在96方孔板中接種3孔。接種的孔數(shù)和稀釋度可以增加，此處接種3孔和3個(gè)稀釋度是為了與國(guó)標(biāo)法做比對(duì)。（4）培養(yǎng)。將接種后的96方孔板放入36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24h。（5）接種。反復(fù)振蕩96方孔板，然后用接種針蘸取底部變黑或疑似底部變黑的孔中培養(yǎng)物，穿刺接種于RPFA平板，每孔至少穿刺5次。將穿刺后的RPFA平板放入36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6-24h。金黃色葡萄球菌能夠使RPFA中的兔血漿凝固，從而使菌落周圍出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)。（6）結(jié)果判斷。接種的RPFA平板上出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)的孔標(biāo)記為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性孔。按金黃色葡萄球菌陽(yáng)性孔數(shù)，檢索MPN表或使用MPN計(jì)算軟件，得到每g（ml）樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)。

2.國(guó)標(biāo)MPN檢測(cè)法操作步驟。按照《GB 4789.10-2016/第三法金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)法》進(jìn)行。

3.分析方法。（1）相對(duì)精度（relative trueness）分析。選擇4種常見的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的食品樣品，用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別進(jìn)行人工污染，分別按照國(guó)標(biāo)MPN檢測(cè)法和快速M(fèi)PN檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。每種樣品檢測(cè)5次，用所有4種樣品的5次平行數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖，其中不同種的樣品用不同的形狀表示，并畫出兩種方法對(duì)每個(gè)被分析樣本得出相同結(jié)果時(shí)的直線，這樣可以快速直觀地評(píng)估這兩種方法不一致的程度。計(jì)算每對(duì)數(shù)據(jù)的平均值和每對(duì)數(shù)據(jù)值之間的差異，并按樣品種類對(duì)所有參數(shù)繪制Bland-Altman一致性分析圖，從而直觀地說明數(shù)據(jù)的偏倚程度和一致性程度。（2）精度曲線（accuracy profile）分析。精度曲線用于檢查快速M(fèi)PN檢測(cè)法與國(guó)標(biāo)MPN檢測(cè)法產(chǎn)生的結(jié)果相差是否小于某個(gè)可接受標(biāo)準(zhǔn)值，這個(gè)可接受標(biāo)準(zhǔn)值在本文中設(shè)置為±0.5log10單位，也可以通過方法使用者與最終用戶之間達(dá)成的共識(shí)來決定。用6份含低中高濃度的人工污染樣品（全脂奶粉）檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制精度曲線，以此比對(duì)兩種檢測(cè)方法在乳制品檢測(cè)中的一致程度。（3）凝固酶實(shí)驗(yàn)靈敏度初探。快速M(fèi)PN檢測(cè)法用穿刺接種RPFA替代傳統(tǒng)轉(zhuǎn)接兔血漿來確定菌株是否含有凝固酶，考慮到穿刺法接種的接種量遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)法的接種量，為驗(yàn)證穿刺接種的有效性，需對(duì)其做靈敏度驗(yàn)證。將金黃色葡萄球菌接種至BHI肉湯，在36℃條件下培養(yǎng)24h后，使用GB 4789.2-2016對(duì)其計(jì)數(shù)。分別用100、101、102、103、104級(jí)稀釋液穿刺RPFA，同時(shí)接種7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯，在36℃條件下接種24h后再次穿刺接種RPFA。

三、結(jié)果與分析

1.相對(duì)精度分析結(jié)果。根據(jù)四種樣品經(jīng)人工污染后通過兩種方法檢測(cè)的結(jié)果（結(jié)果取對(duì)數(shù)），全脂奶粉的平均差值為0.39，差值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27;速凍水餃的平均差值為0.40，差值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21;豬肉香腸的平均差值為0.22，差值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10;三文魚片的平均差值為0.27，差值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15。具體數(shù)據(jù)詳見表1，再將其繪制成散點(diǎn)圖和Bland-Altman一致性分析圖，詳見圖1和圖2。由散點(diǎn)圖（圖1）可見，無明顯偏離等差線（y=x）的結(jié)果點(diǎn)出現(xiàn)，說明兩種方法得出的檢測(cè)結(jié)果沒有出現(xiàn)極端的差異;由Bland-Altman一致性分析圖（圖2）可見，僅有一個(gè)結(jié)果差異點(diǎn)出現(xiàn)在95%下限之下，說明兩種方法得出的檢測(cè)結(jié)果的差異具有很大程度上的一致性。

2.精度曲線分析結(jié)果。6份中低高不同染菌量的全脂奶粉，用兩種檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)5個(gè)平行后，得到的檢測(cè)結(jié)果見表2。將其繪制成精度曲線圖，見圖3。由精度曲線圖（圖3）可見，兩種方法得出的檢測(cè)結(jié)果的差異均在所設(shè)的可接受極限（AL）內(nèi)，說明兩種方法產(chǎn)生的結(jié)果差異性可接受。

3.凝固酶試驗(yàn)靈敏度初探分析結(jié)果。（1）當(dāng)菌液含菌量少于104CFU/mL時(shí)，直接穿刺RPFA后有部分接種點(diǎn)無菌落生長(zhǎng)。當(dāng)菌液含菌量在104CFU/mL以上時(shí)，所有接種點(diǎn)均有菌落生長(zhǎng)，并且全部能夠產(chǎn)生凝固酶反應(yīng)。也就是說，只要7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯管中的金黃色葡萄球菌能夠達(dá)到104CFU/mL，快速M(fèi)PN檢測(cè)法即可檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。（2）將100、101、102、103、104級(jí)稀釋液接種7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯，在36℃條件下接種24h后穿刺RPFA，所有接種點(diǎn)均發(fā)生凝固酶反應(yīng)。也就是說，當(dāng)樣品中的金黃色葡萄球菌含量低至個(gè)位數(shù)時(shí)，經(jīng)快速M(fèi)PN檢測(cè)法增菌后依然可以檢出陽(yáng)性結(jié)果。

四、結(jié)論與討論

本文介紹了一種食品中金黃色葡萄球菌快速M(fèi)PN檢測(cè)法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)周期短，相比國(guó)標(biāo)法可以縮短24小時(shí)，并且操作步驟簡(jiǎn)單，省去了劃線分離等步驟。在與國(guó)標(biāo)金黃色葡萄球菌MPN法的方法比對(duì)研究中，通過相對(duì)精度分析和精度曲線分析可以非常直觀地看出，兩種方法對(duì)常見的幾種食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性。由于本方法操作簡(jiǎn)單，非常適合增加檢測(cè)管數(shù)，檢測(cè)管數(shù)越多，結(jié)果準(zhǔn)確性就越高，值得推廣使用。

本文中凝固酶試驗(yàn)靈敏度分析雖然是對(duì)本方法中凝固酶試驗(yàn)靈敏度的初步研究，但卻證明了該方法的可行性，由于作者個(gè)人精力有限，未能在整體方法的靈敏性、特異性、包含性、排斥性等方面一一展開論述，歡迎對(duì)此感興趣的人士一起參與研究，一起為祖國(guó)的檢測(cè)行業(yè)貢獻(xiàn)一份力量。

作者簡(jiǎn)介：凌超（1989-），男，上海，本科，工程師，研究方向：食品檢測(cè)。