許金根, 胡 洪, 王重龍, 李慶崗*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(Insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs)的生物學(xué)作用主要是與胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)結(jié)合,通過(guò)延長(zhǎng)IGF的半衰期而調(diào)節(jié)IGF的功能,以及獨(dú)立于IGF的內(nèi)在活性。作為

IGFBP3

家族的一個(gè)重要成員,

IGFBP3

是血清中與IGF結(jié)合的主要蛋白,通過(guò)調(diào)控IGF的生物活性而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育起作用。因此,

IGFBP3

是影響豬生長(zhǎng)發(fā)育的功能候選基因。研究發(fā)現(xiàn),大白豬

IGFBP3

基因G3695A位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的生長(zhǎng)速度和背膘厚存在顯著差異。在長(zhǎng)白豬×藍(lán)塘豬F資源群中,

IGFBP3

基因A2670G位點(diǎn)與體長(zhǎng)、眼肌面積、皮與脂肪率、胴體瘦肉量、瘦肉率存在顯著或極顯著相關(guān)。在藍(lán)塘豬×長(zhǎng)白豬雜交 群體中,

IGFBP3

不同合并基因型TAT/TAT與GGC/GGC個(gè)體的背膘厚、肉色存在顯著差異。豬

IGFBP3

基因序列已被克隆出來(lái),包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。但目前關(guān)于豬

IGFBP3

基因序列及其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特征的研究比較少。因此,本試驗(yàn)綜合利用生物信息學(xué)分析豬

IGFBP3

基因序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特征,為研究該基因在豬生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),下載豬

IGFBP3

基因mRNA序列(登錄號(hào):NM001005156)及其編碼的蛋白質(zhì)序列(登錄號(hào):NP001005156)。

同時(shí)，下載其它種屬黃牛(登錄號(hào):NP_776981)、水牛(登錄號(hào):XP_006051369)、綿羊(登錄號(hào):NP_001152748)、山羊(登錄號(hào):NP_001301148)、貓(登錄號(hào):XP_023105911)、狗(登錄號(hào):XP_003639605)、小鼠(登錄號(hào):NP_032369)、大鼠(登錄號(hào):NP_036720)、雞(登錄號(hào):NP_001094504)和鴨(登錄號(hào):XP_027307091)的IGFBP3蛋白序列。

1.2 試驗(yàn)方法

用DNASTAR軟件的EditSeq分析豬

IGFBP3

基因編碼區(qū)堿基組成。用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)的ProtParam(Https://web.expasy.org/protparam/)分析豬IGFBP3蛋白理化特性。用SOPMA軟件(Https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析豬IGFBP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)(Http://smart.embl-heidelberg.de/)分析豬IGFBP3蛋白功能域。

用CBS數(shù)據(jù)庫(kù)(Http://www.cbs.dtu.dk/services/)的SignalP 4.1分析豬IGFBP3蛋白的信號(hào)肽,用TMHMM 2.0分析豬IGFBP3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。用NetPhos 3.1和NetNGlyc 1.0分別預(yù)測(cè)豬IGFBP3蛋白的磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)。

用DNAStar軟件的MegAlign模塊(Jotun Hein法,PAM設(shè)為250),分析不同物種IGFBP3氨基酸序列的同源性。用MEGA 5.0軟件的鄰接(Neighbor-Joining)法,構(gòu)建不同物種IGFBP3氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),自展值(Bootstrap)設(shè)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬IGFBP3基因序列分析

豬

IGFBP3

基因mRNA序列,編碼區(qū)長(zhǎng)882 bp(位于107～988處),共編碼293個(gè)氨基酸。豬

IGFBP3

編碼區(qū)的A、G、C、T含量分別為17.57%、34.47%、35.83%、12.13%,A+T含量(29.70%)低于G+C含量(70.30%)。

2.2 豬IGFBP3蛋白理化性質(zhì)分析

經(jīng)ProtParam軟件分析,豬IGFBP3蛋白分子式為CHNOS,相對(duì)分子質(zhì)量為31 722.27,理論等電點(diǎn)為8.97,不穩(wěn)定系數(shù)為48.17,脂肪系數(shù)為61.06,平均親水系數(shù)為-0.592。豬IGFBP3蛋白的氨基酸組成中,Val含量最高(占10.6%),Trp含量最低(占0.7%),正電荷(Asp和Glu)數(shù)31個(gè),負(fù)電荷(Arg和Lys)數(shù)43個(gè)(表1)。

表1 豬IGFBP3蛋白氨基酸組成

2.3 豬IGFBP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)SOPMA程序分析,豬IGFBP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含61個(gè)α螺旋(占20.82%)、24個(gè)延伸鏈(占8.19%)、15個(gè)β轉(zhuǎn)角(占5.12%)和193個(gè)無(wú)規(guī)卷曲(占65.87%)(圖1)。經(jīng)SMART軟件分析,豬IGFBP3蛋白存在1個(gè)位于第38～118處的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白同源物(IB)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)位于第239～291處的甲狀腺球蛋白Ⅰ型重復(fù)(TY)結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.4 豬IGFBP3蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)SignalP 4.1軟件預(yù)測(cè),豬IGFBP3蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第27～28處(圖3)。經(jīng)TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè),豬IGFBP3蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖3 豬IGFBP3蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 豬IGFBP3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 豬IGFBP3蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn)分析

經(jīng)NetPhos 3.1預(yù)測(cè),豬IGFBP3蛋白含26個(gè)磷酸化位點(diǎn),分別為17個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(位于第23、29、140、142、147、150、158、169、185、194、196、203、204、206、233、256和289處)、5個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(位于第159、172、199、210和222處)和4個(gè)酪氨酸位點(diǎn)(位于第192、212、248和270處)(圖5)。經(jīng)NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè),豬IGFBP3蛋白含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn),分別位于第118、138和201處(圖6)。

圖5 豬IGFBP3蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖6 豬IGFBP3蛋白N-糖基化化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.6 不同動(dòng)物IGFBP3蛋白同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)DNASTAR軟件的MegAlign分析,豬IGFBP3蛋白與水牛、黃牛、山羊、綿羊、貓、狗、小鼠、大鼠、雞和鴨的氨基酸序列同源性分別為91.2%、90.8%、87.8%、87.8%、87.2%、86.9%、82.3%、81.2%、73.9%和73.3%(圖7)。IGFBP3蛋白氨基酸序列在不同動(dòng)物中的同源性較高,表明IGFBP3蛋白在進(jìn)化中較保守。

圖7 IGFBP3氨基酸序列同源性分析

利用MEGA軟件對(duì)不同動(dòng)物IGFBP3氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖8)。豬IGFBP3蛋白與同屬于偶蹄目的水牛、黃牛、山羊和綿羊親緣關(guān)系最近,與雞和鴨親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這與氨基酸同源性分析結(jié)果一致,表明IGFBP3的發(fā)育進(jìn)化符合物種進(jìn)化規(guī)律。

圖8 基于IGFBP3氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(鄰接法)

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn),150日齡的肥胖型太湖豬IGFBP3 mRNA表達(dá)量極顯著低于瘦肉型長(zhǎng)白豬。西藏小型豬肝臟、腎臟、肌肉、心臟IGFBP3 mRNA表達(dá)量均高于軍牧一號(hào)豬,腎臟中IGFBP3蛋白含量顯著高于軍牧一號(hào)豬。提示

IGFBP3

基因與豬的脂肪沉積、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。因此,研究

IGFBP3

基因及其編碼蛋白序列的結(jié)構(gòu)和特征,為進(jìn)一步研究

IGFBP3

基因?qū)ωi生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控提供參考。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析了豬

IGFBP3

基因及其編碼蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)特征。豬

IGFBP3

基因編碼區(qū)長(zhǎng)882 bp,共編碼293個(gè)氨基酸,G+C含量(70.30%)高于A+T含量(29.70%)。豬IGFBP3蛋白的分子式為CHNOS,相對(duì)分子質(zhì)量為31 722.27,理論等電點(diǎn)為8.97,不穩(wěn)定系數(shù)為48.17(>40),為不穩(wěn)定蛋白,脂肪系數(shù)為61.06,平均親水系數(shù)為-0.592(<0),為親水性蛋白。豬IGFBP3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲(65.87%)和α螺旋(20.82%)構(gòu)成,而延伸鏈(8.19%)和β轉(zhuǎn)角(5.12%)比例較低。豬IGFBP3蛋白存在1個(gè)IB結(jié)構(gòu)域和1個(gè)TY結(jié)構(gòu)域,這與山羊IGFBP3蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

豬IGFBP3蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第27～28處,即存在一個(gè)長(zhǎng)27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,但不存在跨膜結(jié)構(gòu),這與綿羊IGFBP3蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果一致。磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式。本研究預(yù)測(cè)豬IGFBP3蛋白含26個(gè)磷酸化位點(diǎn)(包括17個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸位點(diǎn))和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn),表明這些氨基酸殘基是豬IGFBP3蛋白潛在的修飾位點(diǎn)。豬IGFBP3氨基酸序列與水牛、黃牛、山羊和綿羊的同源性最高,與貓、狗、小鼠和大鼠的同源性>80%,表明IGFBP3蛋白序列在哺乳動(dòng)物中的保守性較高。IGFBP3氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示,豬與水牛、黃牛、山羊、綿羊親緣關(guān)系近,這與氨基酸同源性分析結(jié)果一致。