吳 琳 吳 芳 劉婭楠 張 娜 陶成斌 張延英 徐曉艷

(1.甘肅中醫(yī)藥大學/甘肅省實驗動物行業(yè)技術中心，蘭州 730000)(2.甘肅省第二人民醫(yī)院/西北民族大學附屬醫(yī)院，蘭州 730000)(3.民勤縣蘇武鎮(zhèn)羊路衛(wèi)生院，武威 733300)(4.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，蘭州 730000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，缺血性腦卒中以高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率危害人們健康。缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中的60%～70%[1]，是威脅人類生命的主要疾病之一。研究腦卒中，建立腦缺血再灌注動物模型必不可少。血管內線栓閉塞法(線栓法)大腦中動脈阻塞模型，為一種理想的、目前應用最廣泛的腦缺血動物模型制備方法[2]，是局灶性腦缺血的標準動物模型[3]。描述線栓法操作的詳細步驟及每一步注意事項未見相關報道，為使研究者提高模型制備成功率，提供便捷的實驗步驟參考，參考Longa等[4]的研究，將相關內容敘述如下。

1 實驗準備

1.1 實驗物品

帶有固定裝置的鼠用手術臺、刀片(或脫毛膏、電推子)、軟皂液、線剪、眼科剪(維納斯剪)、皮鑷、眼科直鑷、眼科彎鑷、鼠用撐開器、頭端處理過的尼龍線或魚線(根據大鼠體型選擇規(guī)格，在距離頭端2.0 cm處做好標記，使用前消毒處理)、動脈夾(小號)、2-0絲線、3-0絲線、圓針、三角針、持針器、小彎鉗、2 mL注射器、一定濃度的麻醉劑、電子稱、碘伏、脫脂棉求及照明臺燈。

1.2 實驗動物

大鼠具有與人類相似的解剖結構，抗感染能力強，選擇變異較小的Fischer-344 大鼠或SD大鼠，實驗前禁食12～24 h，避免高血糖增加梗死面積[3]。

2 操作步驟

2.1 麻醉及固定

在缺乏大鼠人工輔助通氣，術中連續(xù)監(jiān)測心電圖、血壓等實驗室條件時，推薦按45 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉[3,5]。

麻醉大鼠后，大鼠翻正反射消失確定為麻醉成功，將大鼠門齒及四肢分別固定于手術臺上，使大鼠呈仰臥位且頸部皮膚展平。

術者位于大鼠尾側，本文將以阻斷大鼠右側大腦中動脈為例，為便于描述，文中方位以大鼠左側為左，大鼠右側為右，頭側端為上，尾側端為下。

2.2 備皮

可用刀片或電推子備皮。由于頸部組織柔軟，備皮范圍四周突出骨骼的影響，很難將頸部皮膚拉緊并與突出骨在同一水平，使用刀片時容易將皮膚劃壞，可以涂抹軟皂液后用刀片刮毛，多次練習，達到理想的備皮效果，使備皮部位鼠毛平于皮膚表面。使用電推子備皮，不能很好去除頸部鼠毛，可能影響消毒效果等。

備皮范圍，尾側至鎖骨水平，左右至兩側下頜角平行腹中線范圍，頭側盡可能靠上，備皮范圍呈上窄下寬的梯形。將刮下的鼠毛置于水中，避免毛到處亂飛，清理干凈頸部掉落的鼠毛，避免進入手術視野，影響操作、手術效果及預后。

2.3 消毒

用蘸有碘伏的棉簽或止血鉗夾持的棉球消毒，消毒范圍至備皮邊緣外側約0.5 cm。由于實驗于SPF設施進行，同時便于術中觀察大鼠呼吸及皮膚色澤，不建議鋪洞巾，但應設置專門放置手術器械的容器，減少手術器械的污染，每做完一只鼠后器械消毒，減少大鼠術中感染概率。

2.4 手術切口的選擇

于前正中線，以胸骨水平向上約0.5 cm處起，至下頜角水平上0.5 cm，長約2.5 cm，以剛能放進鼠用撐開器為宜。皮鑷夾住胸骨上0.5 cm處皮膚，沿前正中線方向用線剪剪一小口，后用皮鑷將此切口下端夾持牽拉向下，用線剪挑起開口頭側端，沿切口向上剪開皮膚，以減少皮下組織損傷，且開口邊緣整齊，在一條直線上，美觀且便于縫合。

2.5 分離血管

2.5.1分離目標血管前準備：為避免出血較多，鈍性分離淺筋膜，即于前正中線沿切口方向撕開，兩側較大的球形腺體表面淺筋膜盡量完好，以免暴露腺體遮擋手術視野。沿前正中線氣管表面，用鑷子或止血鉗鈍性分離氣管表面的肌肉(胸舌骨肌)，上至胸舌骨肌止點，向下與切口對齊。提起胸舌骨肌右側半頭側部分，分別沿兩側胸舌骨肌內側面向下鈍性分離。由于只分離手術側，放置撐開器后會牽拉氣管，致使氣管偏向對側，影響大鼠呼吸，遂將兩側頸前肌均依照前法分離。若從下向上分離胸舌骨肌，易將止于甲狀軟骨并斜形覆蓋于頸總動脈表面呈束狀的肌肉游離，影響手術視野。操作過程中應注意動作輕柔，避免拉斷肌纖維，造成不必要的損傷。分離前明確所有目標血管位置(圖1)。

圖1 大鼠頭頸部血管示意圖[1]

2.5.2放置撐開器：避免將頸總動脈(CCA)表面斜形走向止于甲狀軟骨的肌肉置于撐開器下面，否則會遮擋視線，影響后續(xù)操作，甚至拉斷此肌纖維束。

2.5.3分離頸總動脈：于CCA靠內側邊緣用眼科彎鑷逐層分離頸動脈鞘，便于游離CCA，同時減少刺激與其伴行的迷走神經及交感神經，約齊平第5氣管軟骨環(huán)，CCA表面有頸總靜脈一屬支，避免損傷，可于其上，即靠頭側分離CCA，用2-0或0號絲線橫穿CCA，不打結，止血鉗夾閉絲線兩端用于牽引，必要時可牽拉此牽引線進行緊急止血。

2.5.4分離頸外動脈前處理：約平行于甲狀軟骨下緣處CCA分為頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA分叉之前，分叉下0.1～0.3 cm處有一神經盤旋呈“C”形跨于CCA表面，可將其用眼科鑷分離、牽拉至氣管側，不影響后續(xù)分離及操作。牽拉頸總動脈牽引線，繼續(xù)向上可分離CCA分叉及ECA、ICA，先于靠近胸舌骨肌內側壁，將此肌肉與血管分叉、ECA、ICA及血管外包被的組織分離開，動作輕柔，可無滲血，若有滲血，以大小適中脫脂棉球壓迫止血。分離于胸舌骨肌止點水平時尤其注意動作輕柔，若過于粗暴，會引起較多滲血，且不易快速止血，若有滲血可脫脂棉球壓迫止血。由于棉球壓迫面積及受力點可以隨意調節(jié)，同時壓迫的面積相對較大，建議以小棉球止血。

距ECA與ICA分叉約0.4 cm處，ECA第二支分支即甲狀腺上動脈，在放置撐開器并未進行分離狀態(tài)下，此血管先向背離地面方向走行，向外側方走行，小心分離并結扎甲狀腺上動脈(條件允許，可用電凝筆離斷，很大程度提高工作效率)，避免連接于ECA的盲端過長。如此可避免損傷此動脈，從而避免大量出血。若不結扎此動脈，后續(xù)操作很容易將此動脈牽拉致出血，以致止血無效，同時魚線不能以直線路徑插入大腦中動脈。值得注意的是，實驗過程中發(fā)現，一部分甲狀腺上動脈于頸總動脈發(fā)出，可先行將其結扎。

2.5.5分離頸外動脈：離斷甲狀腺上動脈后，便于繼續(xù)分離干凈ECA周圍的組織，使ECA游離出長0.6～0.7 cm?？捎诜蛛x一段長度后，以4-0絲線結扎ECA時邊結扎邊分離，即先于距離CCA分叉約0.5 cm處進行一次結扎；輕輕牽拉此結扎線繼續(xù)分離ECA，在ECA遠心端留有離斷后線結不會脫落長度的位置進行第二次結扎。注意打緊線結，避免線結脫落，同時注意適度用力，避免將ECA于打結時暴力拉斷。若被覆于ECA周圍筋膜等不分離干凈，后續(xù)ECA結扎線易于滑脫，影響“V”形切口制作，同時不便觀察“V”形切口位置，影響后期魚線插入。

輕輕牽引近心端線結，于兩線結間剪斷ECA，使ECA留有0.4～0.5 cm盲端。留近心端線結尾線，減少牽拉此尾線次數。剪去頭側端線結尾線，可避免后期操作時將此線結撕脫，例如，在放置或取下ICA動脈夾時因尾線過長，被夾于動脈夾中致線結撕脫。即使撕脫當時未見出血，但留有隱患，不便發(fā)現死亡原因，一般會在造模結束后因出血過多以及血塊壓迫氣管窒息而亡。3-0或2-0絲線由于線結較大，占用較長血管，使ECA盲端較短，且線結易滑脫。

2.5.6分離頸內動脈：分離ICA時注意避免損傷ECA第一個分支枕動脈，距離分叉0.1 cm，直徑約0.05 cm，并與ICA 伴行。為避免之后魚線誤入此動脈，可先將其離斷，若操作熟練，可不處理。鈍性分離ICA周圍組織，盡量避免刺激、離斷ICA周圍神經。確定CCA分叉與動脈夾間距離≥0.2 cm，便于確定魚線插入位置。若保證動脈夾可穩(wěn)定夾閉ICA，可不必將其周圍組織剃除干凈；操作不熟練，建議分離干凈其周圍組織，完全暴露ICA，但致使損傷增加。

2.6 插入魚線及魚線的固定

首先將CCA近心端(于橫跨CCA的頸總靜脈屬支下方)及ICA遠心端用大小合適的動脈夾夾閉，放松牽引線，使兩動脈夾之間的盲管沒有張力。此時于ECA近心端放置一根4-0絲線待用，提起ECA盲端，建議提起結扎線尾線的其中一根，用眼科剪于盲端靠近線結0.1 cm處做一“V”形切口，夾取帶有刻度的魚線，使其與ECA成45°夾角，緩緩插入至ICA，并于ECA根部4-0絲線打結一次(非方結或死結，方結即打結兩次)初步固定栓，確保松開ICA上動脈夾不會引起出血，但可輕松活動魚線。

“V”形切口形成后，盡量不要松開ECA牽引線，便于觀察切口位置；切口處出血可作為切口位置的標志；不要蘸去“V”形切口處血液，可避免擠壓致血管塌陷；若兩動脈夾間張力過大、盲管內血液被擠出，或不便找到“V”形切口位置，可鑷子夾閉CCA近心端，將CCA上的動脈夾松開，可有少量血液充盈盲管，便于重新找到“V”形切口。單人操作時，魚線插入后，可先止血鉗輕輕牽拉ECA盲端結扎線(注意向尾側牽拉，使魚線穩(wěn)定于ICA內，此時魚線未固定)，再于ECA根部結扎線打結一次；若有助手，可一人牽引盲端結扎線并固定魚線，一人打結。

取下ICA上動脈夾，牽拉CCA牽引線，使ICA與前正中線成約45°，魚線與前正中線成35°～40°，并盡可能與地面成0～15°，避免將線打彎，可拇指在上，余四指在下持鑷夾持魚線，緩緩插入大腦中動脈(MCA)，進入超過1.0 cm時，即確定魚線頭端越過翼腭動脈起始處時，輕輕松開CCA牽引線，繼續(xù)緩緩向頭端插入，稍遇阻力立即停止前進，此時，魚線進入1.8～2.0 cm，魚線上的標記剛好于CCA分叉處。再次打結，完成ECA根部固定線的方結，以魚線可于血管內活動、松開CCA上動脈夾不出血為準。

魚線越過翼腭動脈后松開CCA牽引線，可避免魚線進入過多；同時由于ICA彈性回縮，可能帶動魚線扎破MCA，導致蛛網膜下腔出血，使大鼠于術后72 h內死亡。若未能一次進入，略微調整角度回抽一部分魚線重新插入。若用力過大，會使魚線彎曲，影響后續(xù)再次嘗試插入。

2.7 術部處理

2.7.1檢查術野：松開CCA上動脈夾但先不拿去，查看ECA盲端有無出血，確定無出血則完全去掉動脈夾；若有出血，重新結扎ECA根部結扎線。確保手術視野無滲血。

2.7.2縫合：拿去撐開器，碘伏或酒精棉球消毒皮膚，2-0或0號絲線連續(xù)全層縫合，避免留有死腔。打結要緊，避免線頭太長，因為大鼠會用爪子撓，有時可撕破皮膚。

2.7.3術后處理：松開四肢及頭端固定線，將大鼠分籠安置于溫暖環(huán)境，注意保溫。注意垃圾分類處理。

2.8 再灌注

于魚線插入后90 min進行再灌注。此時，用手將大鼠頸部皮毛固定，由于大鼠術后疼痛，再灌注使掙扎明顯，必要時再次進行麻醉，將露在皮外的魚線向外退0.5～1 cm，并剪短，以避免大鼠活動等將魚線回插，扎破血管造成再次損傷。再灌注過程中避免將全部魚線退出，即使再灌注后未見明顯滲血，24 h內也會造成頸部出血過多或壓迫氣管導致窒息使模型制作失敗。

3 模型制備的評價

根據Longa等的評分方法[4, 6]，在大鼠麻醉清醒后，具體以0分為無神經功能缺損，1分：對側前爪不能完全伸展，2分：向對側轉圈，3分：向對側傾倒，4分不能行走或意識喪失；評分1～3分視為為模型制備成功。