李高輝 呂文良 閆 暾 李娟梅 武慶娟 趙 婷

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院感染疾病科，北京 100053)(2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

肝纖維化是肝臟修復(fù)過程中出現(xiàn)的生理病理過程，但是長期致病因素刺激或相關(guān)細胞因子缺乏會引起纖維增生而降解相對或絕對不足而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)不斷沉積，最終發(fā)展成為肝硬化。因此，阻止肝纖維化的進展對慢性肝疾病的治療至關(guān)重要。Popper[1]曾強調(diào)指出誰能阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生，誰就能治愈大多數(shù)慢性肝病。隨著近年來學(xué)科交叉的不斷研究深入，肝纖維化過程可以被終止甚至得到逆轉(zhuǎn)[2]的結(jié)論不斷得到證實。

動物實驗?zāi)軒椭藗兞私饧膊〉陌l(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療。目前，實驗室誘導(dǎo)鼠類肝纖維化模型的主要方法[3-6]有四氯化碳法、硫代乙酰胺法、二甲基亞硝胺法和二乙基亞硝胺法、膽總管結(jié)扎法、D-半乳糖胺法、免疫法、乙醇法、營養(yǎng)法、血吸蟲法、慢性病毒感染法、復(fù)合法等。四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型在形態(tài)學(xué)及病理生理學(xué)的某些方面與人肝纖維化相似，如兩者均有肝細胞壞死后的再生，實驗動物表現(xiàn)的體征及肝功能異常與人慢性肝病進展為肝硬化過程相似[7]。只是在實際的實驗過程中，因為缺乏統(tǒng)一的造模標準，造成了模型誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)造模不及或太過導(dǎo)致肝硬化，動物過多死亡等問題，影響后續(xù)實驗的科學(xué)性。本文采取文獻數(shù)據(jù)分析的方法對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型進行分析和再評價。

1 方法

1.1 文獻搜集

計算機檢索數(shù)據(jù)庫“中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、維普網(wǎng)”以“四氯化碳”“CCl4”“肝纖維化”“動物模型”為關(guān)鍵字進行文獻檢索，對文獻下方相關(guān)參考文獻也進行檢索，文獻發(fā)表時間為2015年1月1日—2020年12月31日。

1.2 文獻閱讀和數(shù)據(jù)摘錄

閱讀文獻了解實驗思路和造模過程，選取相關(guān)數(shù)據(jù)錄入Excel表格以備篩選。臨床上，肝組織穿刺活檢仍是診斷肝纖維化的標準方法[8]，因此，在評價造模是否成功時，參考2019年《肝纖維化診斷及治療共識》，以實驗中的肝臟病理切片為主要評價依據(jù)，動物最終的肝臟病理組織形成假小葉為重要參考。近年來, 無創(chuàng)傷性的血清學(xué)檢查方法得到普及，甚至有作者提出肝纖維化血清學(xué)檢測在特定的條件下可以代替肝組織活檢[9]。目前，診斷肝纖維化常用的生化指標有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、Ⅲ型前膠原(PCIII)、透明質(zhì)酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)等。參與肝纖維化的細胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白、蛋白多糖及黏連蛋白三大類，PC-Ⅲ、HA、LN分別是這三種細胞外基質(zhì)成分的代表[10]。因此，摘錄文獻中有關(guān)肝纖維化血清學(xué)檢測空白對照組和模型組的指標數(shù)據(jù)。

1.3 排除標準

①排除沒有病理切片輔證的文獻。②排除四氯化碳與其他方法混合誘導(dǎo)肝臟損傷的文獻。③排除動物為非SPF級Wistar或SD大鼠的文獻。④排除造模后應(yīng)用藥物干預(yù)前沒有相關(guān)檢測數(shù)據(jù)判斷其肝纖維化程度的文獻。⑤排除數(shù)據(jù)用線圖表示，不能進行數(shù)據(jù)挖掘分析的文獻。⑥排除綜述類文獻。

2 檢索文獻結(jié)果

中國知網(wǎng)共檢索到文獻180篇，萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺數(shù)據(jù)庫檢索到99篇，維普網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索到32篇。去除重復(fù)文獻，總文獻數(shù)為141篇。按照“排除標準”排除46篇。

3 數(shù)據(jù)摘錄與處理

文獻數(shù)據(jù)摘錄時發(fā)現(xiàn)，對肝纖維化判斷除病理結(jié)果之外，血清學(xué)指標差異較大，所以選取檢測率高的ALT和AST為血清學(xué)評價指標，最終納入評價范圍的文獻數(shù)量為60篇。應(yīng)用Excel表格記錄文獻題目、動物品系、性別、藥物作用途徑、四氯化碳濃度及劑量、用藥頻率、動物死亡率、病理檢查結(jié)果及血清學(xué)ALT和AST檢驗結(jié)果。

對病理檢查結(jié)果依“Ishak”纖維化評分進行打分。分值為1打1分，分值為6打6分。血清血指標計算其“升高率”，對“升高率”進行劃檔打分，AST升高率：小于1時記2分，在1～2記3分，在2～4記4分，大于4記5分。ALT升高率：小于2記2分，在2～4記3分，在4～6記4分，大于6時記5分。各指標以其在模型評價中的決定程度分別×不同百分比：纖維化評分×40%，AST評分×30%，ALT評分×30%，三個結(jié)果之和為該文獻模型的最終評分。

4 統(tǒng)計分析

表1 四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型文獻統(tǒng)計表

5 結(jié)果

5.1 四氯化碳導(dǎo)致肝毒的機制

四氯化碳進入機體后，經(jīng)肝臟細胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(—CCl3)和三氯甲基過氧自由基(—OOCCl3)， 后者可直接損傷質(zhì)膜,啟動脂質(zhì)過氧化作用，破壞肝細胞的膜性結(jié)構(gòu)等，造成肝細胞變性壞死。國外從20世紀30年代開始使用四氯化碳誘導(dǎo)動物模型，以其操作簡便，經(jīng)濟節(jié)約，周期較短等優(yōu)點至今仍作為經(jīng)典的誘導(dǎo)方法，被科研人員采用。

5.2 動物品系

本文重點搜索Wistar大鼠和SD大鼠誘導(dǎo)模型的文獻。納入評價的文獻中采用Wistar大鼠作為模型動物數(shù)量為11篇，采用SD大鼠作為模型動物數(shù)量為49篇。對雄性Wistar和SD大鼠限定其藥物作用途徑為“皮下注射”和“腹腔注射”，當“皮下注射”時Wistar大鼠為(3.02±0.48)分，SD大鼠為(3.68±0.66)分(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，平均造模時間為Wistar大鼠6.8周，SD大鼠8.5周。當“腹腔注射”時Wistar大鼠為(4.33±0.58)分，SD大鼠為(3.38±0.50)分(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。平均造模時間為Wistar大鼠6.3周，SD大鼠6.9周，可見Wistar與SD對四氯化碳的敏感性并不相同，Wistar大鼠對于腹腔注射的反應(yīng)性更加靈敏，而SD大鼠對皮下注射的反應(yīng)性更好(圖1)。

圖1 不同品系大鼠對不同注射方式的纖維化評分比較

5.3 藥物作用途徑

納入的文獻中，誘導(dǎo)方式為腹腔注射的有19例，皮下注射的有32例，灌胃的有7例，灌腸的有1例，另有1例誘導(dǎo)方式不明。比較同類大鼠，對不同的作用途徑的差異，限定其性別為“雄性”，四氯化碳濃度為“50%”，選取品系為“SD”，比較“皮下注射”“腹腔注射”“灌胃”之間的差異性?！捌は伦⑸洹迸c“腹腔注射”以及“灌胃”兩兩比較的結(jié)果，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。其中，“皮下注射”(3.70±0.70)分，造模周期10.5周；“腹腔注射”(3.50±0.50)分，平均周期8.3周；“灌胃”(3.56±0.56)分，造模周期8.8周(圖2)。

圖2 50%四氯化碳不同用藥方式對雄性SD大鼠的造模評分

對于使用高濃度的四氯化碳油劑進行模型誘導(dǎo)時，多采取低劑量、長周期的方式以提高模型誘導(dǎo)的成功率，但是這意味著實驗效率會受到一定影響。

5.4 四氯化碳濃度

文獻中使用的四氯化碳濃度有20%、40%、50%和60%，限定比較條件為雄性SD大鼠，皮下注射40%四氯化碳油劑，比較40%、50%和60%四氯化碳誘導(dǎo)模型的差異。40%與50%以及60%兩兩相比(P>0.05)，均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。其中，40%(3.71±0.61)分，平均周期8周，50%(3.70±0.92)分，平均周期10.5周，60% 4.00分，平均周期10周。相比40%與50%四氯化碳，二者打分相近，而40%的平均造模時間更短。雖然60%濃度的得分更高，但是相應(yīng)的耗時也更長。

在實際操作中，當選擇不同物種進行肝纖維化模型誘導(dǎo)時，應(yīng)當首先考慮到物種的差異，并且不能將某一方案死板的套用在不同動物上。當確定實驗動物后，然后確定藥物作用途徑。經(jīng)過統(tǒng)計計算，各種作用途徑之間評分雖然沒有明顯的差異，但是在實驗平均用時方面可以看到不同途徑之間的差別。確定作用途徑后，選擇的四氯化碳濃度則可根據(jù)物種和作用途徑來決定，用量和周期之間具有相關(guān)性，用量越大，相應(yīng)周期越短。

綜合以上數(shù)據(jù)，對造模周期進行分析，篩選出以下四種四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的實驗方案：當實驗對性別無要求時，推薦選擇雄性大鼠作為造模對象，當需要選擇不同的品系進行實驗，或者對用藥途徑有要求時可參考表2。

表2 四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的最佳實驗方案

6 討論

6.1 一般情況

在模型誘導(dǎo)期間，模型組均會表現(xiàn)出不同程度的毛色無光、飲食量減少、精神萎靡、行動遲緩、尿黃、大便變稀及體質(zhì)量增長減慢，甚至出現(xiàn)腹水和急性死亡，所以應(yīng)該嚴密注意大鼠的行為表現(xiàn)，結(jié)合我們在實際進行大鼠肝纖維化模型誘導(dǎo)中的經(jīng)驗，當發(fā)現(xiàn)大鼠體質(zhì)量短期內(nèi)發(fā)生較大變化時，應(yīng)該予以重視，可能出現(xiàn)急性肝損傷，導(dǎo)致大鼠食欲降低，造模后期同時應(yīng)該考慮腹水的發(fā)生，應(yīng)對方案為停止對大鼠的繼續(xù)藥物損傷，進一步觀察。皮下注射誘導(dǎo)模型時，應(yīng)該采取輪流注射的方式并注意注射部位的無菌保護，否則容易出現(xiàn)皮毛脫落甚至皮膚潰爛的現(xiàn)象，尤其在夏、冬兩季進行實驗，更需要保證大鼠環(huán)境的無菌和干燥，將飼養(yǎng)環(huán)境溫度、相對濕度控制在合理范圍，避免實驗外部因素造成的大鼠死亡。

6.2 動物品系

不同動物對實驗因素的敏感性不同，因此，對品系的恰當選擇有利于實驗設(shè)計和結(jié)果輸出。用于誘導(dǎo)肝纖維化模型的品系有SD大鼠、Wistar 大鼠、C57[71]小鼠、昆明小鼠、ICR[72]小鼠等，而大鼠具有體型大易于操作和觀察，采血量多且敏感性高，性格溫順等優(yōu)點被大多數(shù)實驗者接受并采用。

6.3 性別因素

目前，研究者多采取雄性大鼠進行模型誘導(dǎo)實驗。劉清華等[73]采用皮下注射40%四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型，并觀察在完整雌性小鼠與切除卵巢的去勢小鼠皮下注射0.002% β-Est(17β-雌二醇)產(chǎn)生的影響，檢測得到去勢+四氯化碳組各項生化指標數(shù)據(jù)遠高于去勢組+四氯化碳+雌激素組和對照組；許君望等[74]通過皮下注射400 mL/L 四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型，觀察雌激素(苯甲酸雌二醇)對大鼠α大平滑肌肌動蛋白表達和對肝臟膠原含量的影響，實驗組大鼠肝臟α滑肌肌動表達明顯高于對照組和四氯化碳+雌激素組，同時肝組織出炎癥、壞死、膠原沉積及假小葉形成，說明雌激素對肝纖維化過程有延緩作用。流行病學(xué)數(shù)據(jù)也顯示肝硬化及其并發(fā)癥在男性中的發(fā)病率高于女性，其發(fā)病率之比為2.3∶1～2.6∶1[75]。因此，造模過程中應(yīng)避免雌激素對實驗結(jié)果的影響而采用雄性實驗動物。

6.4 用藥途徑

目前，采取的四氯化碳用藥途徑主要有腹腔注射、皮下注射、灌胃及四氯化碳吸入[76-77]。四氯化碳是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，能直接損害肝細胞，破壞細胞的各種成份[78]。國內(nèi)采用四氯化碳吸入造模的報道較少，有國外學(xué)者采用此法，10周后僅形成脂肪變性及極少量的肝細胞壞死,且個體差異較大。腹腔注射是采用將四氯化碳油劑直接注射到胃腸到漿膜層以外，經(jīng)腹膜直接吸收進入門靜效率高，皮下注射通常采用的部位是背部皮下和后腿內(nèi)側(cè)皮膚，皮下注射通過微血管吸收，相比腹腔注射吸收速率慢，因此在注射相同濃度的四氯化碳油劑時，腹腔注射組死亡率更高,但周期更短。灌胃是使用灌胃器直接將四氯化碳灌注到胃里，藥液經(jīng)過門靜脈系統(tǒng)吸收，直接進入肝臟，葉霖財?shù)萚72]通過實驗發(fā)現(xiàn)灌胃和腹腔注射的方式均能獲得理想的實驗結(jié)果，其中灌胃死亡率小于10%，而腹腔注射死亡率大于80%，說明灌胃動物耐受性更好；藥物注射是實驗過程的中心環(huán)節(jié)，有資料[79]顯示腹腔注射的小鼠會出現(xiàn)腹膜、腸壁和腹腔臟器粘連現(xiàn)象，以及因為刺破膀胱，腸道引發(fā)感染導(dǎo)致死亡，皮下注射出現(xiàn)皮膚潰爛引發(fā)感染，灌胃時因誤入氣管而導(dǎo)致老鼠死亡，實驗中的人為操作因素對實驗結(jié)果影響較大，這對實驗者的操作熟練程度也提出了一定要求。

6.5 四氯化碳用量

大鼠的用藥濃度為20%～60%，單次用量0.1～0.3 mL/100 g，頻率多為2次/周，造模周期為4～12周。鄭君等[80]指出四氯化碳進入體內(nèi)15 min即可引起肝損傷，48 h達到高峰，隨后肝臟進入修復(fù)階段。史智勇等[81]提出采用低劑量、間歇皮下注射的方法以提高動物生存率。張海燕等[82]在比較實驗中發(fā)現(xiàn)當50%四氯化碳劑量超過2.5 mL/kg時，動物死亡率會升高。我們提出的方案中，考慮到品系的差異性和對不同注射方式的敏感程度，推薦根據(jù)研究目的選擇實驗動物，根據(jù)實驗操作的熟練程度選擇注射方式和用量。

6.6 實驗操作

根據(jù)以往造模經(jīng)驗，我們總結(jié)出四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的注意事項并建議：①較長的造模周期，大鼠體型不斷增大，使大鼠的抓取注射難度增加，我們推薦使用氣體麻醉機，這有助于減輕因大鼠掙扎導(dǎo)致的針尖對其臟器的損傷，減輕大鼠痛苦，符合動物倫理學(xué)要求。②為了注射計量的準確，通常采用1 mL注射器，但1 mL注射器針頭太細易造成油劑阻塞，因此建議采用4.5-5號針頭，為了避免交叉感染，應(yīng)一鼠一針，或者針頭用75%乙醇消毒后再用。③采取腹腔注射時，當針頭刺入腸道時，回抽會見到黃色渾濁液體進入針管，而造模后期可能出現(xiàn)肝硬化腹水的情況，因此在注射器回抽時見到黃色液體時，應(yīng)退出注射器，換另一側(cè)注射，若仍然抽出液體，排除因操作不當刺入腸道外，應(yīng)考慮大鼠肝硬化腹水的發(fā)生。④為了避免刺傷腸道，還可以將大鼠皮毛提起，沿提起的皮下與肌肉成30度角進針，感覺落空感，回抽為負壓后，再進行注射。⑤皮下注射時，應(yīng)該采取輪流更換位置的方法，避免對同一區(qū)域的重復(fù)針刺，并且保證一定的針刺深度，否則四氯化碳油劑容易漏出，影響造模效果。注射完成后可用手按壓皮下包塊，幫助皮下快速吸收。

6.7 存在問題

在文獻的閱讀過程中發(fā)現(xiàn)，不乏有研究者實驗步驟描述不清、使用動物與參考造模文獻有差異、診斷肝纖維化描述模糊等問題，均影響到文獻的可信度。

理想的肝纖維化病理模型應(yīng)具有以下優(yōu)點：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似。②病變有一定發(fā)展過程，病程發(fā)展存在一個可逆與不可逆的階段性演進過程。③形成率高、病死率低和重復(fù)性好。④方法簡便易行。⑤動物易獲得，經(jīng)濟實用。四氯化碳誘導(dǎo)的動物模型在形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)方面與人類肝纖維化多有相似，有自然恢復(fù)的特點。合理規(guī)范的運用四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化對科學(xué)研究無比重要，希望我們的工作可以為此提供有價值的參考。