劉甦蘇 魏 杰 王辰飛 岳秉飛 范昌發(fā)

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

潛在致癌性評價是藥物臨床前安全性評價的重要內(nèi)容，1997年，人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization，ICH)頒發(fā)的S1B指南中就提出了基于遺傳修飾致癌性動物模型的短期評價方法，目的是減少傳統(tǒng)致癌性評價方法存在的周期長、費用高、結(jié)果不夠準(zhǔn)確可靠等局限性。目前這種新的評價方法已經(jīng)獲得美國FDA、歐盟、日本厚生省等機構(gòu)的認(rèn)可[1-4]。我國也在2010年提出了建議使用替代方法的致癌性實驗指導(dǎo)原則[5]，用于指導(dǎo)我國使用嚙齒動物進(jìn)行的藥物致癌性評價研究[4]。其中，常用的小鼠模型為日本實驗動物中心研究所建立的CByB6F1-Tg(HRAS)2Jic小鼠(簡稱CB6F1-CIEA)[6-10]。

由于知識產(chǎn)權(quán)的限制，如將CB6F1-CIEA癌癥模型用于商業(yè)用途和法定檢驗工作需要支付高昂的知識產(chǎn)權(quán)費用，從而間接增加藥物研發(fā)成本。因此，本單位從2004年開始利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法建立了人類原癌基因c-Ha-ras小鼠模型并開展了相關(guān)評估工作[11-13]，并于2013年獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL 2008 1 0101666.0.)[14]，以期建立我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的動物模型。

鑒于實驗動物的臟器質(zhì)量及血液生理生化參數(shù)是藥物臨床前長期毒性研究中必須觀測的項目，受不同基因改造及繁育飼養(yǎng)條件的影響，有必要對將兩種模型的相關(guān)生物學(xué)特征進(jìn)行測定分析[15-16]。所以，本研究測定了實驗用小鼠的臟器及血液學(xué)參數(shù)，以期驗證該模型的合理性并推動我國自建致癌性動物模型的建立及推廣。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

C57BL/6J-Tg(HRAS)轉(zhuǎn)基因小鼠為本單位通過轉(zhuǎn)基因方法自主建立，實驗用動物采用近交系繁殖方式，用C57BL/6J-Tg(HRAS)轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/cJ小鼠交配，并對每代出生的仔鼠通過PCR方法篩選陽性，記為CB6F1-Tg(HRAS)Nifdc(簡稱CB6F1-NIFDC)，日本rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交一代，記為CByB6F1-Tg(HRAS)2Jic，來源于日本實驗動物中心研究，動物飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，飼喂SPF級小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。日本模型在本設(shè)施適應(yīng)性飼養(yǎng)一周時間。實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2017-0005。

1.2 主要儀器及設(shè)備

日本光電Mek7222血細(xì)胞分析儀，儀器精度：WBC 2.0%、RBC 1.5%、HGB 1.5%、MCV 1.0%、PLT 4.0%；Sartorius CPA 423S電子天平；Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀；Thermo Nano Drop超微量分光光度；Eppendorf微量移液器。

1.3 試劑

清洗液DH520、清洗液DH620、稀釋液DH640、溶血劑DH910及溶血劑DH680購自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑和BCA法試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；脫脂奶粉購自France Sparks；38800 Le Pont de Claix及超敏發(fā)光液購自Millipore Corporation；RT-PCR 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成；TE緩沖液及TAE緩沖液自行配置；其他常見生化試劑(乙醇、異戊醇、苯以及氯仿)購自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司；蛋白一抗Anti HRAS Antibody cat: 12059-T52 lot: HD08MA1601-B 購自Sino Biological Inc。

1.4 測定項目及方法

1.4.1體質(zhì)量和臟器指標(biāo)：分別選取10只，6～8周實驗用鼠，雌雄各半。空腹12 h后，活體稱質(zhì)量。眼靜脈采抗凝血20 μL測定血液生理指標(biāo)。安樂處死后解剖取出心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢和睪丸，剔除脂肪和包膜，用生理鹽水清洗血漬，濾紙吸干表面水分后用電子天平稱質(zhì)量，精確到0.001 g。

1.4.2血液生理指標(biāo)：紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(LYM)、單核細(xì)胞計數(shù)(MON)、中性粒細(xì)胞計數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù)(BAS)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)，共22項。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及臟器指標(biāo)測定結(jié)果

表1的臟器絕對值結(jié)果表明，同一周齡不同來源的雌性小鼠的心、肝、肺、左腎及右腎5項指標(biāo)存在一定差異；雄性小鼠的肝、左腎、右腎及胸腺4項指標(biāo)存在一定差異；其中，肝、左腎及右腎3項指標(biāo)雌雄均有極顯著差異(P<0.01)。表2臟器相對值均值結(jié)果表明，同一周齡不同來源的雌性小鼠的肝、肺、左腎及右腎4項指標(biāo)存在一定差異；雄性小鼠的肝、左腎、右腎及胸腺指標(biāo)存在一定差異；其中，肝、左腎及右腎3項指標(biāo)上雌雄均有差異顯著性(P<0.01)。

表1 不同性別的兩種模型的臟器絕對值指標(biāo)(g)

表2 不同性別的兩種模型的臟器絕對值指標(biāo)(g)

2.2 生理指標(biāo)測定結(jié)果

表3的22項血液生理指標(biāo)方面總體均值結(jié)果表明，雌性小鼠在RBC、HGB等7項指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)，LYM和 NEUT 兩項指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)，其余指標(biāo)之間無明顯差異；而雄性小鼠在RBC、HCT等5項指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)，在HCT、PLT及PCT 這三項指標(biāo)上存在顯著差異(P<0.05)，其余指標(biāo)之間無明顯差異。

表3 不同性別的兩種小鼠模型的血液生理指標(biāo)

3 討論

轉(zhuǎn)基因癌癥小鼠模型是對臨床前藥物致癌性評價很有價值的研究模型[2]， 也是ICH推薦的快速評價藥物潛在致癌性的替代方法，其具有時間短(6個月vs 2年)、費用省、結(jié)果可靠、動物使用量少(≤50%/組)等特點，常用的小鼠模型為日本實驗動物中心研究所建立的TgrasH2。近幾年來，隨著新藥研發(fā)項目增加，國內(nèi)藥物安全評價對該類模型動物的需求不斷增加，但多數(shù)情況下，通過中介從日本購買，存在價格高、供應(yīng)周期漫長等弊端。這直接或間接的加重藥物研發(fā)成本，延緩了國內(nèi)創(chuàng)新藥物走向市場，因而非常有必要建立自主知識產(chǎn)權(quán)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因動物模型，以彌補國內(nèi)空缺[17]。

為了分析自建模型特點以及與日本來源的小鼠模型異同，本研究分別選取日本和自建的小鼠模型10只，測定并比較基本生物學(xué)特性[18]。臟器絕對質(zhì)量結(jié)果表明同一性別的兩種模型，雌雄性小鼠在12項指標(biāo)中存在心、肝等4～5項指標(biāo)差異。查閱文獻(xiàn)分析[15]，由于動物本身的個體差異和環(huán)境條件不同，都會影響生長發(fā)育和臟器系數(shù)各項指標(biāo)，自建模型的肝、腎組織稍大于日本模型可能與制作模型的轉(zhuǎn)基因隨機插入方式有關(guān)。22 種血液生理指標(biāo)的初步統(tǒng)計結(jié)果顯示，雌、雄性小鼠組間部分血液生理參數(shù)存在差異，如雌性RBC、HGB 等指標(biāo)間存在差異，進(jìn)一步分析原因，由于自建模型出生后一直飼養(yǎng)于本單位飼養(yǎng)設(shè)施，而日本模型購入后僅適應(yīng)性飼養(yǎng)一周時間，本研究所用動物數(shù)量相對較少、飼料與飼養(yǎng)環(huán)境發(fā)生改變可能產(chǎn)生了模型血液生理指標(biāo)的差異。另外，致癌實驗所用的小鼠是雜交一代動物，自建模型雜交采用的是BALB/cA小鼠，但是日本模型采用的是BALB/cByJ，其相較于完整BALB/cJ小鼠的位點，在?；o酶α脫氫酶短鏈(Acad)位點缺失278 bps，這可能也會導(dǎo)致表型有一定的區(qū)別。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，本單位進(jìn)一步分析了日本模型的基因結(jié)構(gòu)，已著手自主建立了c-Ha-ras定點插入及插入拷貝數(shù)確定的動物模型，并開展了新建立模型動物研究的相關(guān)工作，以期借助現(xiàn)有的技術(shù)平臺(如臨床前藥物安全評價平臺)，建立我國的致癌性小鼠模型，滿足未來我國藥物安全性評價、藥品檢定、新藥創(chuàng)制中對此類遺傳修飾模型的需要[19]。