葉傳進

（南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院（南京市口腔醫(yī)院） 口腔病理科，江蘇 南京）

0 引言

研究牙周組織的生理、病理及病生理機制最常用的方法是免疫組化，牙周組織中硬組織鈣含量較多，硬脆、易碎、難切；軟組織則易受拉扯、擠壓產(chǎn)生變形分離甚至脫落。因此牙-牙周組織切片的制作難度較大，且對免疫組化尤其是抗原修復和緩沖液長時間浸泡染色的過程中容易發(fā)生脫片現(xiàn)象。牙-牙周免疫組化染色切片的效果對實驗結果影響較大，本研究即分析高壓修復、酶修復、隔水熱修復3種抗原修復方法對牙-牙周免疫組化切片染色的效果，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

壓力鍋；復合消化酶和兔抗鼠巨噬細胞單克隆抗體，免疫組化MaxVision檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒；檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH值6.0）；PBS緩沖液（2000 mL/包、pH 值 7.2~7.4）。

取用頸椎脫位法致其死亡的成年健康雄性大鼠，取出大鼠上下頜骨磨牙區(qū)組織塊，用10%中性甲醛液固定24 h，10% EDTA 脫鈣3~4周，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 組織切片處理

將組織蠟塊于-20 ℃下冷凍2 min后取出，使用輪轉切片機連續(xù)切2 μm一片的切片，將切片展開后再使用粘附載玻片撈片，為保證切片效果應確保每張切片在載玻片中心位置。將上述組織切片每組各撈20片一共3組，將水溫調(diào)整至46 ℃后把切片攤開，使組織與載玻片平整粘附，然后于70 ℃烤片機上將切片與載玻片牢固結合，效果達到不出現(xiàn)重力移位現(xiàn)象即可將載玻片放入烘片機，溫度調(diào)整為60 ℃，烘烤2 h。

1.2.2 切片脫蠟水化處理

將完成上述切片處理的切片放進通風櫥中的二甲苯脫蠟劑中進行脫蠟處理3次，每次10 min，確保脫蠟干凈后進行梯度水化，梯度水化為無水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每個梯度水化5 min。

1.2.3 抗原修復

1.2.3.1 高壓法抗原修復

切片盒中倒入適量檸檬酸鹽緩沖液，將組織切片插入切片盒，高壓鍋中水煮沸后將切片盒放入加熱，設定電磁爐1000 W，待高壓鍋噴氣后加閥1.5~2 min，后等待修復液自然冷卻至室溫。

1.2.3.2 酶消化法抗原修復

組織切片上滴加復合消化酶，將組織切片置入保濕盒，放置進溫箱，溫度調(diào)整至37 ℃，時間20 min。上述完成后將組織切片取出，用PBS緩沖液進行漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.3.3 隔水熱法抗原修復

將組織切片置入有檸檬酸鹽緩沖液的切片盒中，放入水浴鍋中加熱，待鍋內(nèi)水溫達到92 ℃，維持并加熱40 min，然后待緩沖液自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.4 組織切片染色

待上述3種修復完成后將免疫組化切片進行染色。具體為：將組織切片自PBS緩沖液中取出并甩干水分，放入DAB顯色試劑盒，靜置3 min待切片盡可能吸干顯色液，然后將切片置入DAB清洗液中水洗，后滴加蘇木素復染30 s。

1.2.5 脫水、透明、封片

脫水處理：95%乙醇脫水1 min→無水乙醇脫水1 min→無水乙醇脫水1 min；透明處理：將切片架放進二甲苯透明劑中透明，3 min/次，進行2次；封片標記處理：中性樹膠滴入切片中封片，標記歸類。

1.3 觀察指標

脫片即組織切片與載玻片未牢固結合，與載玻片分離、脫落、懸浮等情況。對上述切片處理后的脫片情況進行歸類如下：輕度脫片：切片脫離載玻片面積在10%以下；中度脫片：切片脫離載玻片面積在10%~80%；重度脫片：切片脫離載玻片面積超過80%。脫片率=（輕度脫片+中度脫片+重度脫片）/所有切片×100%。顯效染色：切片染色均勻，能清除觀察到研究組織；有效染色：切片染色比較均勻，可以觀察到研究組織；無效染色：切片染色不均，無法有效觀察到研究組織。染色率=（顯效染色＋有效染色）/所有切片×100%。

綜合考慮脫片率和染色率后對3種抗原修復法進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

將數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0軟件中分析，計數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3種抗原修復中牙-牙周免疫組化切片的脫片率對比

酶消化修復的脫片率最低，隔水熱修復次之，高壓修復的脫片率最高，見下表1。

表1 3種抗原修復中牙-牙周免疫組化切片的脫片率對比（n, %）

2.2 3種抗原修復中牙-牙周免疫組化切片的染色率對比

高壓修復的染色率最高，隔水熱修復次之，酶修復的染色率最低，見下表2。

表2 3種抗原修復中牙-牙周免疫組化切片的染色率對比（n, %）

3 結論

免疫組化染色技術是根據(jù)抗原與抗體特異性結合的原理。利用化學反應將顯色劑標記于特異抗體上，借助顯微鏡對抗原抗體結合部位觀察從而確定組織細胞結構的一門新技術[1]。免疫組化的染色質(zhì)量受整個試驗過程多方面因素的影響，如溫度、抗原修復方法、抗體濃度、孵育時間及顯色時間等多種因素[2-4]。本研究中牙-牙周組織兼具軟硬兩種組織，切片制作難度較大，在抗原修復中保持切片完整較為復雜，研究使用3種方法分別為高壓修復、酶修復、隔水熱修復對組織切片進行染色以觀察效果。

高壓修復優(yōu)點在于染色效果好，運用高壓鍋進行封閉的加熱處理，加熱效能大而均勻，但是組織脫片率很高，更適合于牙齦乳頭等牙周軟組織的免疫組化染色；酶消化修復是通過消化作用破壞修復液固定產(chǎn)生的蛋白交聯(lián)，使抗原位點暴露，其巨噬細胞染色效果一般，但是組織脫片率低，也能有效觀察到研究組織；隔水熱修復效果居于高壓修復和酶消化修復之間，染色率較好，脫片率居中[5-6]。

本研究中由于牙-牙周組織的特殊性，具有軟硬兩種組織，脫片情況發(fā)生較多，綜合考慮高壓修復、酶消化修復和隔水熱修復，對三種抗原修復方法的染色率和脫片率綜合分析，認為隔水熱抗原修復的綜合效果最好，雖然染色效果較好，且需延長修復時間，但能有效觀察到研究組織且脫片率較低。

綜上所述，在對牙-牙周免疫組化染色中，使用隔水熱修復的綜合效果最好。