葉傳進

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院（南京市口腔醫(yī)院） 口腔病理科，江蘇 南京）

0 引言

研究牙周組織的生理、病理及病生理機制最常用的方法是免疫組化，牙周組織中硬組織鈣含量較多，硬脆、易碎、難切；軟組織則易受拉扯、擠壓產(chǎn)生變形分離甚至脫落。因此牙-牙周組織切片的制作難度較大，且對免疫組化尤其是抗原修復(fù)和緩沖液長時間浸泡染色的過程中容易發(fā)生脫片現(xiàn)象。牙-牙周免疫組化染色切片的效果對實驗結(jié)果影響較大，本研究即分析高壓修復(fù)、酶修復(fù)、隔水熱修復(fù)3種抗原修復(fù)方法對牙-牙周免疫組化切片染色的效果，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

壓力鍋；復(fù)合消化酶和兔抗鼠巨噬細(xì)胞單克隆抗體，免疫組化MaxVision檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒；檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH值6.0）；PBS緩沖液（2000 mL/包、pH 值 7.2~7.4）。

取用頸椎脫位法致其死亡的成年健康雄性大鼠，取出大鼠上下頜骨磨牙區(qū)組織塊，用10%中性甲醛液固定24 h，10% EDTA 脫鈣3~4周，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 組織切片處理

將組織蠟塊于-20 ℃下冷凍2 min后取出，使用輪轉(zhuǎn)切片機連續(xù)切2 μm一片的切片，將切片展開后再使用粘附載玻片撈片，為保證切片效果應(yīng)確保每張切片在載玻片中心位置。將上述組織切片每組各撈20片一共3組，將水溫調(diào)整至46 ℃后把切片攤開，使組織與載玻片平整粘附，然后于70 ℃烤片機上將切片與載玻片牢固結(jié)合，效果達(dá)到不出現(xiàn)重力移位現(xiàn)象即可將載玻片放入烘片機，溫度調(diào)整為60 ℃，烘烤2 h。

1.2.2 切片脫蠟水化處理

將完成上述切片處理的切片放進通風(fēng)櫥中的二甲苯脫蠟劑中進行脫蠟處理3次，每次10 min，確保脫蠟干凈后進行梯度水化，梯度水化為無水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每個梯度水化5 min。

1.2.3 抗原修復(fù)

1.2.3.1 高壓法抗原修復(fù)

切片盒中倒入適量檸檬酸鹽緩沖液，將組織切片插入切片盒，高壓鍋中水煮沸后將切片盒放入加熱，設(shè)定電磁爐1000 W，待高壓鍋噴氣后加閥1.5~2 min，后等待修復(fù)液自然冷卻至室溫。

1.2.3.2 酶消化法抗原修復(fù)

組織切片上滴加復(fù)合消化酶，將組織切片置入保濕盒，放置進溫箱，溫度調(diào)整至37 ℃，時間20 min。上述完成后將組織切片取出，用PBS緩沖液進行漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.3.3 隔水熱法抗原修復(fù)

將組織切片置入有檸檬酸鹽緩沖液的切片盒中，放入水浴鍋中加熱，待鍋內(nèi)水溫達(dá)到92 ℃，維持并加熱40 min，然后待緩沖液自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.4 組織切片染色

待上述3種修復(fù)完成后將免疫組化切片進行染色。具體為：將組織切片自PBS緩沖液中取出并甩干水分，放入DAB顯色試劑盒，靜置3 min待切片盡可能吸干顯色液，然后將切片置入DAB清洗液中水洗，后滴加蘇木素復(fù)染30 s。

1.2.5 脫水、透明、封片

脫水處理：95%乙醇脫水1 min→無水乙醇脫水1 min→無水乙醇脫水1 min；透明處理：將切片架放進二甲苯透明劑中透明，3 min/次，進行2次；封片標(biāo)記處理：中性樹膠滴入切片中封片，標(biāo)記歸類。

1.3 觀察指標(biāo)

脫片即組織切片與載玻片未牢固結(jié)合，與載玻片分離、脫落、懸浮等情況。對上述切片處理后的脫片情況進行歸類如下：輕度脫片：切片脫離載玻片面積在10%以下；中度脫片：切片脫離載玻片面積在10%~80%；重度脫片：切片脫離載玻片面積超過80%。脫片率=（輕度脫片+中度脫片+重度脫片）/所有切片×100%。顯效染色：切片染色均勻，能清除觀察到研究組織；有效染色：切片染色比較均勻，可以觀察到研究組織；無效染色：切片染色不均，無法有效觀察到研究組織。染色率=（顯效染色＋有效染色）/所有切片×100%。

綜合考慮脫片率和染色率后對3種抗原修復(fù)法進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

將數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0軟件中分析，計數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種抗原修復(fù)中牙-牙周免疫組化切片的脫片率對比

酶消化修復(fù)的脫片率最低，隔水熱修復(fù)次之，高壓修復(fù)的脫片率最高，見下表1。

表1 3種抗原修復(fù)中牙-牙周免疫組化切片的脫片率對比（n, %）

2.2 3種抗原修復(fù)中牙-牙周免疫組化切片的染色率對比

高壓修復(fù)的染色率最高，隔水熱修復(fù)次之，酶修復(fù)的染色率最低，見下表2。

表2 3種抗原修復(fù)中牙-牙周免疫組化切片的染色率對比（n, %）

3 結(jié)論

免疫組化染色技術(shù)是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。利用化學(xué)反應(yīng)將顯色劑標(biāo)記于特異抗體上，借助顯微鏡對抗原抗體結(jié)合部位觀察從而確定組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一門新技術(shù)[1]。免疫組化的染色質(zhì)量受整個試驗過程多方面因素的影響，如溫度、抗原修復(fù)方法、抗體濃度、孵育時間及顯色時間等多種因素[2-4]。本研究中牙-牙周組織兼具軟硬兩種組織，切片制作難度較大，在抗原修復(fù)中保持切片完整較為復(fù)雜，研究使用3種方法分別為高壓修復(fù)、酶修復(fù)、隔水熱修復(fù)對組織切片進行染色以觀察效果。

高壓修復(fù)優(yōu)點在于染色效果好，運用高壓鍋進行封閉的加熱處理，加熱效能大而均勻，但是組織脫片率很高，更適合于牙齦乳頭等牙周軟組織的免疫組化染色；酶消化修復(fù)是通過消化作用破壞修復(fù)液固定產(chǎn)生的蛋白交聯(lián)，使抗原位點暴露，其巨噬細(xì)胞染色效果一般，但是組織脫片率低，也能有效觀察到研究組織；隔水熱修復(fù)效果居于高壓修復(fù)和酶消化修復(fù)之間，染色率較好，脫片率居中[5-6]。

本研究中由于牙-牙周組織的特殊性，具有軟硬兩種組織，脫片情況發(fā)生較多，綜合考慮高壓修復(fù)、酶消化修復(fù)和隔水熱修復(fù)，對三種抗原修復(fù)方法的染色率和脫片率綜合分析，認(rèn)為隔水熱抗原修復(fù)的綜合效果最好，雖然染色效果較好，且需延長修復(fù)時間，但能有效觀察到研究組織且脫片率較低。

綜上所述，在對牙-牙周免疫組化染色中，使用隔水熱修復(fù)的綜合效果最好。