付丙月，王金虎，王穎超，段崇剛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院·山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟南 250011）

拉帕替尼（商品名泰立沙）是一種口服的小分子表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKI），由英國葛蘭素史克公司研發(fā)，于2007 年3 月由美國食品藥物管理局批準上市，聯(lián)合卡培他濱治療表皮生長因子受體2（HER2）過度表達的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。目前，拉帕替尼在國內(nèi)是曲妥珠單抗耐藥患者的一線治療用藥［1－4］，其多條合成路線及工藝優(yōu)化中，均使用了乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺等有機溶劑［5－12］。為保障藥品質(zhì)量和用藥安全，減輕溶劑殘留對人體及環(huán)境的危害，人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）、各國藥典等均對藥品中有機溶劑殘留量限度作出了規(guī)定。本研究中參照2020 年版《中國藥典（四部）》的相關(guān)規(guī)定，參考文獻［13］的研究方法，采用氣相色譜（GC）法測定拉帕替尼原料藥中7 種有機溶劑的殘留量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890A 型氣相色譜儀，配有7694E 型頂空自動進樣器（美國安捷倫公司）；XS－205 型電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

拉帕替尼原料藥（實驗室自制，批號分別為20190802，20190807，20190812，20190819，20170627，20190820，20190829，純 度 分 別 為 99.9% ，99.8% ，99.9% ，99.8% ，99.9% ，99.9%，99.9%）；二甲亞砜（色譜純，默克股份兩合公司）；N，N－二甲基甲酰胺（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙醇、丙酮、異丙醇、甲苯、二氯甲烷、四氫呋喃（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent DB －624 毛細管柱（30 m×0.32 mm，1.8μm）；色譜柱起始溫度：30 ℃，保持 6 min，以 30℃ ／min的速率升至200 ℃，保持6 min；氫火焰離子化檢測器（FID）溫度：200 ℃；進樣口溫度：200 ℃；載氣：氮氣；流速：2.0 mL ／min；分流比：10 ∶1；頂空進樣瓶容積：10 mL；平衡溫度：80 ℃；平衡時間：35 min；進樣量：5 mL。精密量取混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各5 mL，按上述色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，理論板數(shù)按乙醇峰計不低于3 000。該色譜條件下R 值均＞3，混合對照品溶液各待測組分峰基線完全分離，空白溶劑二甲亞砜對其他成分的色譜峰無干擾。詳見圖1。

圖1 氣相色譜圖1. Ethanol 2.Acetone 3.Isopropanol 4.Dichloromethane 5. Tetrahydrofuran 6.Toluene 7. N，N － dimethylformamide 8.Dimethyl sulfoxideA. Blank solvent B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 Gas chromatograms

2.2 溶液制備

分別取乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1 mL，置100 mL 容量瓶中，制成每 1 mL 分別含乙醇 500 μg、丙酮 500 μg、異丙醇 500μg、二氯甲烷 60μg、四氫呋喃 70μg、甲苯 90μg、N，N－二甲基甲酰胺90 μg 的混合對照品溶液。取拉帕替尼原料藥0.5 g，精密稱定，置10 mL 頂空瓶中，精密加入二甲亞砜5 mL，密封，輕搖使溶解，即得供試品溶液。精密量取二甲亞砜5 mL，置10 mL 頂空瓶中，密封，即得空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品溶液0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加入二甲亞砜定容，搖勻，即得系列線性混合對照品溶液。精密量取上述溶液各5 mL，置10 mL 頂空瓶中，加蓋密封，于頂空進樣器中平衡30 min，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積（ Y）為縱坐標(biāo)、各組分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表1。

定量限（LOQ）與檢測限（LOD）確定：取混合對照品溶液，加二甲亞砜逐級稀釋，進樣測定，按信噪比（S／ N） ＝10計算 LOQ，按 S ／ N ＝ 3 計算 LOD。結(jié)果見表 1。

精密度試驗：精密量取混合對照品溶液5 mL，共6 份，置 10 mL 頂空瓶中，密封，按 2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果表明儀器精密度良好，詳見表1。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20190820）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，置10 mL 容量瓶中，加入混合對照品溶液0.5 mL，加二甲亞砜定容，搖勻。精密量取供試品溶液5 mL，共6 份，置10 mL 頂空瓶中，密封，分別于室溫下放置 0，2，4，6，10，16 h 時，按 2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置16 h 內(nèi)穩(wěn)定，詳見表1。

表1 各待測成分線性回歸方程、線性范圍、LOQ 和LOD 測定及精密度、穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Linear regression equation，linear range，LOQ and LOD，precision，stability and repeatability tests of each component（n ＝6）

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20190820）適量，共6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算溶劑殘留量。結(jié)果均未檢出乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺峰面積，乙醇殘留量的平均值為0.01%，RSD 為 7.90%（n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知有機溶劑含量的樣品（批號為20190820）9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液適量，各3 份，超聲，溶解，按2.1 項下色譜條件進樣測定3 次，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9，%）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝9，%）

2.4 樣品有機溶劑殘留量測定

取 7 批樣品 （批號分別為 20190802，20190807，20190812，20190819，20170627，20190820，20190829）各0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按 2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算有機溶劑殘留量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中有機溶劑殘留量測定結(jié)果（n ＝3，%）Tab.3 Content determination of the residual organic solvents in the sample（n ＝3，%）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

GC 法通常采用水、醇、N，N－二甲基甲酰胺、二甲亞砜等作為溶劑，本研究中 N，N－二甲基甲酰胺是殘留溶劑之一，無法作為溶劑使用；甲苯極性較小、不溶于水；拉帕替尼雖為磺酸鹽形式，但溶于二甲亞砜，難溶于水和乙醇，甲醇中溶解度同樣較低。同時，二甲亞砜保留時間在拉帕替尼各殘留溶劑的保留時間之后，與各組分峰完全分離，對測定結(jié)果無干擾。因此，選用二甲亞砜為提取溶劑。

3.2 進樣方式選擇

頂空進樣通常在低溫下進行，不僅可減少樣品及溶劑對色譜系統(tǒng)的干擾和污染，還可延長色譜柱的使用壽命，優(yōu)勢明顯。本試驗中各待測殘留溶劑的沸點相差較大，特別是二氯甲烷的沸點為39.8 ℃，極易揮發(fā)，受溫度影響明顯，非常適合選用頂空進樣方式。雖然 N，N－二甲基甲酰胺的沸點較高，更適合直接進樣，但試驗發(fā)現(xiàn)，頂空進樣不影響其檢測結(jié)果的準確度，故最終選用頂空進樣方式。

3.3 色譜柱選擇

由于拉帕替尼各殘留溶劑極性差異較大，甲苯極性非常弱，不溶于水，通常被近似認為非極性分子；而 N，N－二甲基甲酰胺屬強極性溶劑，極性僅次于水。因此，考察了INNOWAX 型、HP － 5 型、AT －5 型、DB －WAXETR 型、DB－624 型等多種不同極性的氣相色譜柱，結(jié)果采用DB－624 型色譜柱時，各待測成分色譜峰分離良好，峰形尖銳對稱，無拖尾、漏檢，與其他峰無干擾，故選擇DB－624 型毛細管色譜柱。

3.4 方法評價

本研究中建立的同時測定拉帕替尼原料藥中乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、N，N－二甲基甲酰胺7 種有機溶劑殘留量的頂空GC 法，操作簡便，結(jié)果準確，重復(fù)性好，可用于拉帕替尼原料藥中有機溶劑殘留量的控制。