謝芳，謝華德，李孟偉，彭開(kāi)屏，楊承劍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001)

0 引 言

中國(guó)是世界第三大水牛養(yǎng)殖大國(guó)，其水牛存欄數(shù)僅次于印度和巴基斯坦。近年來(lái)，在市場(chǎng)需求和政策扶持下，奶水牛產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為廣西的優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)[1]，水牛奶產(chǎn)量也位居全國(guó)之最。水牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、維生素等含量均高于黑白花奶，其免疫球蛋白G、溶菌酶、類胰島素生長(zhǎng)因子等更是普通牛乳的5～10倍[2]。與荷斯坦奶牛相比，水牛適應(yīng)能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗病性和免疫力，迄今尚未有水牛瘋牛病例報(bào)道[3]，因此，水牛奶具有較好的食用安全性和較高的商業(yè)價(jià)值。廣西屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫在23℃左右，年平均降雨量達(dá)1 300 mm，正是這種長(zhǎng)年濕熱的氣候特點(diǎn)孕育了口感醇香獨(dú)特的水牛奶。水牛奶也因其豐富的營(yíng)養(yǎng)而成為微生物生長(zhǎng)的溫床[4]，而在自然條件下，溫度和濕度則是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素，季節(jié)起著決定作用[5]。然目前，尚未見(jiàn)有關(guān)廣西地區(qū)水牛乳中微生物組成及水牛乳品質(zhì)受季節(jié)變化影響的報(bào)道。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量測(cè)序作為“下一代”測(cè)序技術(shù)已迅速發(fā)展，它避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的過(guò)程，能檢測(cè)到純培養(yǎng)和非培養(yǎng)不能發(fā)現(xiàn)的低豐度細(xì)菌種類，相較傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，具有準(zhǔn)確率高、耗時(shí)短以及信息處理量大等優(yōu)點(diǎn)[6]。目前，高通量測(cè)序已應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，包括海洋、土壤、植物和腸道環(huán)境，而利用高通量測(cè)序?qū)θ槠愤M(jìn)行研究的報(bào)道較少[7]，以往通過(guò)傳統(tǒng)測(cè)序可以檢測(cè)到可培養(yǎng)和含量較高的菌落，但很難從樣品中獲得曾經(jīng)存活或難以分離的微生物，進(jìn)而不能全面了解微生物的多樣性[8]。因此，本研究擬利用16SrDNA高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)廣西地區(qū)冬、夏兩季水牛乳中的細(xì)菌群落進(jìn)行比較分析，以期全面了解冬、夏兩季水牛乳中菌落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異，旨在為后續(xù)水牛乳加工、安全評(píng)估等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit DNA抽提試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek公司；biowest agArose瓊脂糖，西班牙Biowest；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒，美國(guó)Bioo Scientific；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒，美國(guó)Illumina；Eppendorf 5430 R離心機(jī)、Eppendorf 5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；BioTek ELx800酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek；QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì)，美國(guó)Promega公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700型PCR儀，美國(guó)ABI；Illumina M iseq測(cè)序儀，美國(guó)Illumina。

1.2 樣本采集

水牛乳樣本均取自廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)，隨機(jī)選取10頭健康三品種高代雜交水牛（摩拉×尼里-拉菲×本地沼澤型水牛），于7月中旬（夏季）和12月下旬（冬季）采集樣品，每頭?，F(xiàn)場(chǎng)各采集3管平行，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后將3管奶樣混勻?yàn)?管混合奶樣，冬、夏季各10份混合樣本，共20個(gè)樣本，分別定義為夏季組（X）和冬季組（W），編號(hào)為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10和T1、T2、T 3、T 4、T 5、T6、T7、T8、T 9、T10。采樣前用溫水清洗乳頭，人工佩戴無(wú)菌手套擠奶，樣本經(jīng)50 mL無(wú)菌PC離心管密封好，置于采樣冷藏保溫箱迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于30 min內(nèi)進(jìn)行生乳中細(xì)菌總脫氧核糖核酸（DNA）的粗提取。

1.3 總DNA粗提和PCR擴(kuò)增

取40 mL生水牛乳樣本，添加8 mL乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（500 mmol/L，p H 8.0），在6 500 r/min下4℃冷凍離心30 min，用滅菌脫脂棉去掉乳脂層，棄上清液，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）至10 mL，12 000 r/min高速冷凍離心10 min，用1 mL蔗糖緩沖液沖洗兩次（每次12 000 r/min，離心10 min），后懸浮400μL蔗糖緩沖液及2U變?nèi)芫睾?00μg溶菌酶，37℃培養(yǎng)1 h；取上述培養(yǎng)后的樣液，分別加入5μL SDS，12μL EDTA，5μL蛋白酶K及78μL蔗糖緩沖液，55℃孵育1 h，再加入65μL蔗糖緩沖液和135μL氯化鈉（5 mmol/L），最后加入2μL RNase于37℃孵育30 min，用700μL苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）消除蛋白，上下?lián)u勻10次以上，然后18 000×g、4℃離心15 min提取上清，重復(fù)3次，最后加入700μL冰異丙醇（(-20℃預(yù)冷）和20μg糖原（glycogen,Roche Diagnostic），混勻放置5 min，然后-20℃沉淀過(guò)夜。取出過(guò)夜樣本，18 000×g離心30 min獲取沉淀，用70%冰乙醇清洗兩遍（500～750μL，彈起白色沉淀，13 000 r/min離心10～15 min），傾倒上清，將離心管倒放，風(fēng)干DNA，加入50μL PE buffer,70℃孵育5 min，用Nano-Drop2000測(cè)定DNA濃度。

用NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度和濃度，為避免序列太長(zhǎng)影響測(cè)序，同時(shí)兼顧擴(kuò)增特異性，選用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16SrDNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s)，然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進(jìn)行保存[9]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4μL，2.5mmol/L d NTPs 2μL，上游引物（5μmol/L）0.8μL，下游引物（5μmol/L）0.8μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20μL。每個(gè)樣本3個(gè)PCR重復(fù)，將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,SanDiego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)上傳至美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads。使用的UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行分類操作單元(OUT)聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU 128），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。菌群多樣性分析及繪圖：均采用R語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)、OTU及稀釋曲線分析

通過(guò)對(duì)冬季組和常夏季組共計(jì)20個(gè)樣本進(jìn)行16SrDNA測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到有效序列690880條，冬季組和夏季組分別得到優(yōu)化序列條數(shù)為345440條。兩組樣本的優(yōu)化序列長(zhǎng)度均主要分布在401～440 bp，集中在421～440 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度300 bp左右接近，可滿足序列分析要求。

圖1 樣本有效序列長(zhǎng)度分布

在97%相似性水平下對(duì)兩組所有樣本序列進(jìn)行聚類分析[10]，結(jié)果見(jiàn)圖2，冬季組和夏季組共注釋出1126個(gè)OTU，兩組共有的OTU為502，冬季組共產(chǎn)生1105個(gè)OUT，夏季組共產(chǎn)生523個(gè)OTU，各自獨(dú)有的OTU分別為603和21。由此可見(jiàn)，冬季組OTU數(shù)遠(yuǎn)高于夏季組，兩組水牛乳樣本間存在大量共有的細(xì)菌菌群，且冬季組中細(xì)菌多樣性高于夏季組。

圖2 樣本OTU分布韋恩圖

稀釋性曲線主要反映測(cè)序深度，根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來(lái)判斷本次測(cè)序數(shù)量是否足夠，也間接反映出樣本中菌群的豐富度和多樣性[11]。Sobs和Shannon指數(shù)分別用于評(píng)估樣本群落的豐富度和多樣性[12]。兩組樣本基于OTU的Sobs和Shannon稀釋曲線結(jié)果如圖3所示。各樣本的群落豐富度Sobs指數(shù)稀釋曲線大部分還在上升期，但群落多樣性Shannon指數(shù)稀釋曲線在2000條時(shí)就已經(jīng)平緩，說(shuō)明增加測(cè)序數(shù)量可能會(huì)發(fā)現(xiàn)少量新的OTU，但樣本群落多樣性不會(huì)增加[13]，說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)量可滿足后續(xù)分析要求。

圖3 Sobs（a）、Shannon（b）指數(shù)稀釋性曲線

2.2 細(xì)菌組成與豐度差異比較

基于OTU注釋結(jié)果，分析樣本在不同分類水平上的群落組成。本次測(cè)序，Coverage（覆蓋率）為0.999，可代表99.9%的樣本信息。冬季組樣本共得到19個(gè)細(xì)菌門，92個(gè)目，185個(gè)科，456個(gè)細(xì)菌屬和733個(gè)細(xì)菌種。而夏季組樣本共得到14個(gè)細(xì)菌個(gè)門，63個(gè)目，127個(gè)科，274個(gè)細(xì)菌屬和424個(gè)菌種，相較而言，冬季組的細(xì)菌多樣性顯著高于夏季組。為可視化呈現(xiàn)各樣本的物種豐度信息，本研究采用柱形圖來(lái)展示各樣本在門水平和屬水平的菌落分布及差異性[14]，結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖4可知，在門分類水平上，以相對(duì)豐度≥0.01%為閾值，將＜0.01%的菌門歸為others，初乳和常乳組共得到6個(gè)細(xì)菌門，從高到低依次為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、Patescibacteria、Deinococcota。其 中 厚 壁 菌 門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、（Deinococcota）在冬季組中占比較多，而變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、（Patescibacteria）則在夏季組中較占優(yōu)勢(shì)，同一菌門在不同樣本中的相對(duì)豐度差異較大。變形菌門、厚壁菌門為兩組樣本中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度分別為55.4%和22.9%，合計(jì)達(dá)78.3%。

圖4 門水平菌落豐度圖

在屬水平上，兩組樣本豐度≥0.01的細(xì)菌屬共有33個(gè)（圖5）。其中，冬季組檢測(cè)到豐度≥2%的有12個(gè)細(xì)菌屬，從高到低依次為：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、土地桿菌屬（Pedobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、醋桿菌屬（Acetobacter）、棲水菌屬（Enhydrobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）；而夏季組豐度≥2%的細(xì)菌屬有7個(gè)，即：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）、TM 7a菌屬、棲水菌屬（Enhydrobacter）。

圖5 屬水平菌落豐度圖

將冬季和夏季兩組樣本中豐度≥0.01%的相同菌屬豐度占比求和后進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示，夏季組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium），而冬季組的優(yōu)勢(shì)菌屬則為：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、土地桿菌屬（Pedobacter）。由此可知，冬、夏兩季水牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌群差異顯著，相同菌屬在不同樣本中的占比均不同，冬季組樣本的菌群多樣性顯著高于夏季組。

表1 冬夏兩季水牛乳中相同菌屬及其相對(duì)豐度

在屬分類水平，取兩組樣本平均總豐度前30的菌屬，按其物種和樣本層級(jí)聚類方式繪制群落豐度聚類熱圖（圖6），使高豐度和低豐度菌落分區(qū)聚集[15]，通過(guò)顏色梯度變化來(lái)反映不同分組樣本在屬水平群落組成的相似性和差異性。由圖6可知，夏季組和冬季組樣本中優(yōu)勢(shì)菌群的豐度呈現(xiàn)明顯不同，顏色梯度交替出現(xiàn)，整體沒(méi)有分區(qū)聚集趨勢(shì)，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）在夏季組樣本中的含量顯著高于冬季組，而芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、土地桿菌屬（Pedobacter）在冬季組中的豐度均遠(yuǎn)高于夏季組。不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）在兩組樣本中均占比較高，葡萄球菌屬（Staphylococcus）在兩組樣本中均有低豐度出現(xiàn)。

圖6 樣本基于屬水平的菌落聚類熱圖

2.3 細(xì)菌多樣性比較分析

本試驗(yàn)采用樣本層級(jí)聚類樹(shù)來(lái)分析水牛乳冬季和夏季組間群落組成的相似性。20個(gè)樣本基于OTU的樣本層級(jí)聚類樹(shù)如圖7所示，通過(guò)樣本聚類樹(shù)可以清楚地看出樣本間分支距離遠(yuǎn)近，較直觀地反映出各樣本間菌群的相似度和差異性[16-17]。由圖7可知，夏季組樣本（紅色）主要聚在一大類分支上，相似度較高，其中F8和F9是最相似的兩個(gè)樣本。冬季組（藍(lán)色）樣本則較分散，主要分成三大類，其中T1、T9、T 10、T7這4個(gè)樣本聚成一類，與大部分夏季組樣本同聚在一大分支上，而T 8、T 5、T 6則與T3、T4分別單獨(dú)聚成兩類分支，且這兩層級(jí)樣本完全不在一個(gè)分支上，樣本間相似度差異較大。整體而言，冬季組與夏季組樣本組間差異不顯著，夏季組樣本組內(nèi)間菌落組成相似度較高，而冬季組樣本組內(nèi)間菌落組成差異較大。

圖7 樣本層級(jí)聚類分析

對(duì)夏季與冬季組樣本中細(xì)菌屬進(jìn)行主成分（PCA）分析，以顯示兩組樣本間菌群組成的相似性和差異性。樣本通過(guò)降維后，在主成分顯示的相對(duì)坐標(biāo)點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似[18]，同理，各點(diǎn)之間距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[19]，由圖8可知，夏季組與冬季組兩組樣本點(diǎn)之間的距離較近，在空間上沒(méi)有完全分開(kāi)，這說(shuō)明冬季組與夏季組組間樣本菌群結(jié)構(gòu)相似，差異不顯著。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)樣本差異性的貢獻(xiàn)分別達(dá)到了51.79%和19.43%，共計(jì)71.22%，可以代表大部分變量信息。由圖8可知，夏季組與冬季組在第一主成分PC1所在的X軸方向，兩組樣本的菌落組成沒(méi)有明顯的分離趨勢(shì)，這說(shuō)明PC1因素有較高的可能性影響了樣本的組成，則表示結(jié)果數(shù)據(jù)組內(nèi)重復(fù)性好，組內(nèi)樣本差異性大，且PC1貢獻(xiàn)值為51.79%，可以作為有效的主成分，來(lái)解釋兩組樣本的組間差異。

圖8 樣本基于屬水平的主成分分析

PLS-DA（偏最小二乘法判別分析Partial Least Squares Discriminant Analysis）是一種常見(jiàn)的檢驗(yàn)樣本組間差異的方法，此方法主要根據(jù)分組方案，弱化組內(nèi)樣本差異，突出組間差異[20]。由PLS-DA（圖9）顯示，除去離群嚴(yán)重的異常樣本T 3，其余樣本點(diǎn)均按夏季與冬季所代表的分組相對(duì)聚集，兩組樣本點(diǎn)在COMP1和COMP2方位很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)，這說(shuō)明夏季與冬季兩組樣本在組間的細(xì)菌組成存在明顯差異，且夏季組代表的樣本點(diǎn)都比較集中，說(shuō)明夏季組組內(nèi)樣本間菌群組成較相似，而冬季組所代表的樣本點(diǎn)都比較分散，這說(shuō)明冬季組組內(nèi)樣本菌群組成有一定的差異性。結(jié)合PCA和PLS-DA分析可知，冬季組與夏季組組間差異顯著，組內(nèi)差異不顯著。

圖9 樣本基于屬水平的PLS-DA分析

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用16SrDNA高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)廣西水牛研究所種畜廠存欄最多的三品雜水牛在冬、夏兩季水牛乳樣本中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示：冬季組樣本共得到19個(gè)細(xì)菌門，456個(gè)屬和733個(gè)種。而夏季組樣本共得到14個(gè)門，274個(gè)屬和424個(gè)種，相較而言，冬季組的細(xì)菌多樣性顯著高于夏季組。兩組樣本優(yōu)勢(shì)菌群組成及豐度差異顯著，組內(nèi)差異小，組間差異大。隨著氣溫升高，夏季組中的乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）占優(yōu)勢(shì)，而氣溫下降后，冬季組中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）和土地桿菌屬（Pedobacter）則成為優(yōu)勢(shì)菌群，這說(shuō)明水牛乳中細(xì)菌多樣性與季節(jié)氣候因素密切相關(guān)，這與大部分國(guó)外研究結(jié)果不同，究其原因，可能是因?yàn)閺V西地區(qū)冬少夏多，長(zhǎng)年濕熱，季候區(qū)分不明顯所致。通過(guò)本次測(cè)序，全面掌握了水牛研究所種畜場(chǎng)三品雜水牛乳中的益生菌與致病群分布狀況，這對(duì)后續(xù)改善該種畜場(chǎng)飼養(yǎng)條件、奶源衛(wèi)生以及奶水牛乳腺炎的前期防治等均有指導(dǎo)意義。