鄭燕燕，朱雨田，李錦才，黎燕玲，何麗香

（深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣東），深圳518131）

0 引 言

維生素A、D均屬于脂溶性維生素。維生素A功能上可防止夜盲癥和視力減退，同時可維護上皮組織細胞的健康和促進免疫球蛋白的合成、維持骨骼正常生長發(fā)育以及抑制腫瘤生長，缺乏維生素A可導(dǎo)致兒童發(fā)育不良、干眼病、夜盲癥等疾病的發(fā)生[1]。維生素D功能上可防止佝僂病，同時可促進皮膚細胞生長、分化及調(diào)節(jié)免疫功能作用，缺乏維生素D的兒童可患佝僂病，成人患骨質(zhì)軟化癥[2-3]。而另一方面，維生素A、維生素D攝入過量時，也會對人體產(chǎn)生較大危害，由于該類脂溶性維生素不易通過尿液排出體外，容易在體內(nèi)大量蓄積，從而引起皮膚、骨骼、腦、肝等多種臟器組織病變，對人體健康造成巨大影響[4-6]。GB10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》及GB10767-2010《食品安全國家標準較大嬰兒和幼兒配方食品》均規(guī)定了維生素A和維生素D的含量范圍[7-8]。維生素A和維生素D的測定在保障嬰幼兒配方食品質(zhì)量安全中發(fā)揮重要作用，因此開展此項能力驗證工作對確保實驗室維持該項檢測能力在較高水平具有至關(guān)重要意義[9-11]。

嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，但樣品均勻性好，方便樣品制備，且維生素A和維生素D在嬰幼兒配方乳粉中可以穩(wěn)定存在，符合能力驗證樣品的穩(wěn)定性和均勻性要求。該項目有相應(yīng)的國家標準檢測方法[12]，方法成熟穩(wěn)定，已被廣泛采用，可以保證本能力驗證項目順利完成。本能力驗證的目的是為了了解和評價目前國內(nèi)嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D檢測能力和水平，識別實驗室間存在的差異，推動和提高參加實驗室檢測嬰幼兒配方乳粉中維生素A、D的技術(shù)能力和水平，起到規(guī)范實驗室管理的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品設(shè)計及制備

本次能力驗證的測試樣品為嬰幼兒配方乳粉，所涉及項目為維生素A、維生素D。根據(jù)方案設(shè)計，制備3組樣品（組別編號分別為A、B、C），為了盡可能地與日常檢測嬰幼兒配方乳粉一致，同時保證樣品制備時的均勻性，由兩家品牌乳粉生產(chǎn)商采用濕法噴霧干燥工藝制備所需樣品原料。定量（40 g/包）分裝，真空密封后，放入鋁箔袋中封好。分裝后的樣品，粘貼唯一性標識，常溫、避光儲存。

1.2 樣品均勻性檢驗

樣品均勻性檢驗按CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（以下簡稱“CNAS-GL003:2018”）[13]、GB/T 28043-2019《利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法》（以下簡稱“GB/T 28043-2019”）附錄B的規(guī)定[14]，從分裝好的三組能力驗證樣品中各隨機抽取10份，維生素A采用GB 5009.82-2016《食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定》（以下簡稱“GB 5009.82-2016”）第一法進行檢測，維生素D采用GB 5009.82-2016第四法進行檢測。均勻性檢驗由同一檢測人員在同一時間段使用相同測試方法、相同測試條件、同一測試儀器對抽取的每份樣品進行2次測試。采用單因子方差分析法，通過F檢驗初步評價3組樣品的均勻性，結(jié)果表明樣品之間無顯著差異，證明樣品是均勻的，可以進行樣品發(fā)放。參加實驗室檢測數(shù)據(jù)回收后，采用SS≤0.1δE準則再次評價樣品均勻性（SS表示樣品間標準差，δE表示最大允許誤差），結(jié)果（SS＜0.1δE）滿足均勻性的要求。

1.3 樣品穩(wěn)定性檢驗

本次能力驗證項目穩(wěn)定性測定方法同均勻性檢驗，對3個水平樣品進行穩(wěn)定性檢驗。均勻性檢驗符合要求后，在樣品發(fā)放前和回收實驗結(jié)果后兩個時間點，分別從制備好的能力驗證樣品中各隨機抽取6份樣品，每份樣品獨立進行2次檢測。穩(wěn)定性檢驗涵蓋整個計劃實施周期，按CNAS-GL003:2018、GB/T 28043-2019附錄B規(guī)定，采用t檢驗法中“二個平均值之間的一致性”方法及|x-y|≤0.1δE準則進行評定。結(jié)果表明，本次能力驗證樣品穩(wěn)定性滿足要求。

1.4 檢測方法

本次能力驗證推薦采用GB 5009.82-2016進行測定，每份樣品報送2次平行測定結(jié)果的平均值。樣品前處理偏離情況及所用儀器設(shè)備、標準物質(zhì)等信息需要在結(jié)果報告單中詳細說明。

1.5 樣品的發(fā)放

按預(yù)先分組情況，從3組樣品中的兩組各隨機抽取1包樣品，放入粘貼有快遞單的白色泡沫盒內(nèi)，記錄樣品編號、實驗室代碼，核對無誤后，再使用膠帶進行包裝，以快遞的方式向各參加實驗室發(fā)放考核樣品。

1.6 指定值的確定

按GB/T 28043-2019附錄C中算法A計算穩(wěn)健平均值（x*），以x*作為本次能力驗證的指定值（X）。

1.7 評價依據(jù)

（1）本次能力驗證結(jié)果評價的參數(shù)為百分相對差（D%）。具體計算公式如下：

（2）判定原則。

根據(jù)GB/T 32465-2015《化學分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》第7.4條及GB 5009.82-2016第7、21、28條對精密度的要求[15]。設(shè)置2倍的維生素A、D的精密度為本次能力評定百分相對差的判定限值，即20%、30%。本次能力驗證判定原則設(shè)置如下：

維生素A項目：當兩個樣品的維生素A項目檢測結(jié)果均符合｜D%｜≤20%時，結(jié)果為滿意；當兩個樣品的任一維生素A項目檢測結(jié)果符合｜D%｜＞20%時，結(jié)果為不滿意。

維生素D項目：當兩個樣品的維生素D項目檢測結(jié)果均符合｜D%｜≤30%時，結(jié)果為滿意；當兩個樣品的任一維生素D項目檢測結(jié)果符合｜D%｜＞30%時，結(jié)果為不滿意。

2 結(jié)果與分析

2.1 參加實驗室概況

參加本次能力驗證的機構(gòu)為224家（強制參加實驗室有186家，自愿報名參加實驗室有38家），來自全國30個省、自治區(qū)和直轄市，其中報名參加維生素A項目有221家，報名參加維生素D項目有198家。統(tǒng)計結(jié)果顯示，有1家參加實驗室未反饋維生素A測試結(jié)果，4家實驗室未反饋維生素D測試結(jié)果，實際收到維生素A測試結(jié)果220項、維生素D測試結(jié)果194項。參加本次能力驗證的實驗室行業(yè)及地域分布情況見表1、表2。

表1 參加實驗室的行業(yè)分布及占比

表2 實際參加實驗室地域分布情況

2.2 能力統(tǒng)計結(jié)果

本次能力驗證的結(jié)果數(shù)、穩(wěn)健平均值、最大允許誤差、穩(wěn)健標準差、指定值不確定度、穩(wěn)健變異系數(shù)等統(tǒng)計量匯總見表3。本次能力驗證維生素A項目的最大允許誤差為指定值的，維生素D項目的最大允許誤差為指定值的。指定值不確定度ux均小于0.1δE，表明本次能力驗證指定值的不確定度可以忽略不計。

表3 檢測結(jié)果統(tǒng)計量匯總表

2.3 結(jié)果統(tǒng)計及評價

分別統(tǒng)計3組維生素A和維生素D結(jié)果分布的頻率，繪制分布頻率直方圖，見圖1～3，圖中表明本次能力驗證回收的結(jié)果服從單峰、近似對稱分布，用穩(wěn)健統(tǒng)計技術(shù)算法A進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

圖1 A組樣品參加者結(jié)果直方圖

本次能力驗證共224家實驗室參加，報名參加維生素A和維生素D的實驗室數(shù)量分別為221家和198家，其中實際回收維生素A項目結(jié)果220家，結(jié)果滿意實驗室為182家，占結(jié)果總數(shù)的82.7%，不滿意實驗室為38家，占結(jié)果總數(shù)的17.3%；維生素D項目結(jié)果提交實驗室共計194家，結(jié)果滿意實驗室為182家，占結(jié)果總數(shù)的93.8%，不滿意實驗室為12家，占結(jié)果總數(shù)的6.2%，具體見表4。各組維生素A、D評價情況見表5、表6。

表4 各測試項目評價情況匯總表 家

表5 各組維生素A項目評價情況匯總表

表6 各組維生素D項目評價情況匯總表

2.4 技術(shù)分析與建議

2.4.1 檢測方法的差異

反饋維生素A結(jié)果的220家實驗室中，有217家均采用了GB 5009.82-2016第一法對維生素A進行測定；1家實驗室使用了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測維生素A，但該方法的適用范圍并不包含維生素A，屬于使用了偏離的標準方法，且該實驗室的維生素A屬于不滿意結(jié)果，但該實驗室并未提供相關(guān)方法驗證材料，無法進一步分析；2家實驗室聲稱依據(jù)GB 5009.82-2016第三法同時對維生素A和維生素D進行了測定，但該方法不能同時檢測維生素A和維生素D，屬于實驗室對所使用的標準發(fā)生了偏離，且其中1家實驗室維生素A結(jié)果為不滿意。

圖2 B組樣品參加者結(jié)果直方圖

圖3 C組樣品參加者結(jié)果直方圖

反饋維生素D結(jié)果的194家實驗室中，有93家使用了GB 5009.82-2016第三法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對維生素D進行了檢測，占總數(shù)的47.9%，其中結(jié)果滿意的實驗室占比為89.2%；有99家使用了GB 5009.82-2016第四法高效液相色譜法對維生素D進行了檢測，占總數(shù)的51.0%，其中結(jié)果滿意的實驗室占比為99.0%；2家實驗室偏離GB 5009.82-2016標準，使用同一方法同時對維生素A和維生素D進行檢測，且其中1家實驗室維生素D結(jié)果為不滿意。

2.4.2 檢測過程的質(zhì)量控制

影響檢測結(jié)果準確性的因素有人員、設(shè)備、試劑、方法、環(huán)境等。檢測過程中要嚴格控制好實驗條件，通過分析各參加實驗室反饋的原始記錄，本次能力驗證測定過程中應(yīng)注意以下幾個方面。

（1）樣品前處理操作。樣品前處理是影響結(jié)果準確性的最關(guān)鍵因素之一，測定維生素A和維生素D時，前處理要注意避光操作，防止紫外線對結(jié)果造成干擾。皂化要充分，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀溶液，并適當延長皂化時間。提取時，不宜劇烈振蕩，容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。凈化過程，個別實驗室采用GB 5009.82-2016第四法測定維生素D時，未按標準要求進行凈化，導(dǎo)致較多雜質(zhì)干擾目標物出峰。

（2）標準物質(zhì)的影響。標準物質(zhì)是實驗室定量檢測的準繩，其計量溯源性非常重要。建議實驗室優(yōu)先選用有證標準物質(zhì)，使用過程中，要考慮標準物質(zhì)的純度、有效期、儲存方式及目標成分變化等。同時，在配制標準溶液時，使用的移液管、容量瓶等要經(jīng)過檢定且滿足要求。配制好的維生素A、D標準儲備液，在使用前一定要按GB 5009.82-2016附錄B的要求校正后使用。部分實驗室未對配制的維生素A、D標準儲備液進行校正。標準曲線濃度范圍應(yīng)覆蓋試樣的測定值，某些實驗室計算維生素A含量時超出了線性范圍。

（3）儀器設(shè)備。儀器設(shè)備測試條件的優(yōu)化是影響結(jié)果準確性的重要因素。有個別實驗室沒有做好儀器條件的優(yōu)化，導(dǎo)致目標物與雜質(zhì)的峰分離度不夠，不能滿足準確定量的要求。個別實驗室測定維生素A、D時，色譜峰明顯有雜峰干擾，目標峰與雜峰未明顯分開；個別實驗室選擇維生素D2作為內(nèi)標，利用內(nèi)標法對結(jié)果進行定量，但是維生素D2與維生素D3未完全分開。這些都可能會影響定量結(jié)果的準確性。

（4）檢測方法。應(yīng)嚴格按照所選擇的方法進行測試，如發(fā)生偏離時應(yīng)對方法進行確認，個別實驗室偏離了所選擇的方法，且未使用質(zhì)控樣品或加標回收予以確認。部分實驗室使用GB 5009.82-2016第三法檢測維生素D，但并未按標準要求使用內(nèi)標、標準曲線進行計算，而是偏離標準采用外標法或單點校正計算結(jié)果。對平行樣的精密度控制也尤其重要，個別實驗室上報的同一樣品的精密度不滿足方法要求，說明實驗室內(nèi)重復(fù)性有問題。

2.4.3 參加者結(jié)果誤差分析

從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，某些實驗室檢測維生素A或維生素D時，其各自的兩份樣品結(jié)果存在較為一致的正偏倚或負偏倚，通過對實驗室提供的原始記錄等材料審核發(fā)現(xiàn)，個別實驗室偏離標準，方法誤差可能是造成較大一致性偏倚的原因之一。因?qū)嶒炇姨峁┎牧嫌邢?，無法進一步分析判斷。對于結(jié)果出現(xiàn)一致性較大偏倚的實驗室，建議應(yīng)從方法、儀器、試劑、人員操作等可能存在的系統(tǒng)誤差對結(jié)果進行分析，及時找出可能存在的問題。

3 結(jié) 論

從本次能力驗證結(jié)果來看，我國大多數(shù)檢驗檢測結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果是滿意的，從參加者提供的原始記錄來分析，其檢測能力均基本符合要求。產(chǎn)生不滿意結(jié)果的主要原因包括儀器設(shè)備測試條件、對方法理解、標準物質(zhì)配制、樣品前處理等方面。本次能力驗證部分實驗室結(jié)果出現(xiàn)不滿意情況，建議這些實驗室參照技術(shù)報告給出的信息，根據(jù)相關(guān)的標準和規(guī)范，結(jié)合自身的實際，認真對本實驗室的數(shù)據(jù)進行評估，真正找出差距和問題所在，制定糾正措施，有效整改，對檢測結(jié)果進行有效的質(zhì)量控制，持續(xù)保持和提高技術(shù)能力及管理水平。