董春光，韓一超，楊麗華，劉文俊，韓文儒，陳劍波，武守艷

（山西農業(yè)大學山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，太原030032）

0 引 言

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，該菌不僅能引起動物和人的化膿性炎癥，還是一種食源性病原菌[1-2]。牛奶是公認的健康食品[3]，但我國年人均飲奶量及其質量亟待提高[4]，由于牛奶本身易受微生物污染而腐敗的特性，其食品安全問題也逐漸凸顯，如2012年韓國出口中國的金黃色葡萄球菌污染牛奶事件更引發(fā)公眾對乳產品質量安全的擔憂。因此，探索檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的方法具有重要的意義。牛奶腐敗后可以產生異味，而目前尚未見運用HS-SPME/GC-MS檢測金黃色葡萄球菌污染牛奶的揮發(fā)性代謝物的報道。本文應用HS-SPM E/GC-MS方法，通過條件優(yōu)化，檢測了鮮奶和被金黃色葡萄球菌污染的鮮奶中揮發(fā)性代謝物的差異，為檢測牛奶中的葡萄球菌提供新的思路。

1 實 驗

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

SPME手柄及75μm CAR/PDMS（碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）萃取頭，美國Supelco；Thermo Scientific ISQ單四極桿GC-MS系統(tǒng)，美國Thermo；色譜柱（30 m×0.25mm×0.25μm），美國Thermo；頂空瓶（20 mL），美國Thermo；麥氏比濁管。

1.1.2 試劑

市售巴氏殺菌乳，金黃色葡萄球菌由山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物臨床研究室保存，血瓊脂平板培養(yǎng)基，7.5%的氯化鈉肉湯，生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 鮮奶的無菌檢驗

以無菌操作取鮮奶，接種至7.5%的氯化鈉肉湯中，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)液接種至營養(yǎng)瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.2.2 菌液的制備

取-80℃保存的金黃色葡萄球菌菌種，接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～24 h，進入對數生長期后，利用0.5號麥氏比濁管制成1.5×108mL-1的金黃色葡萄球菌菌液，經梯度稀釋后得到1.5×107mL-1的金黃色葡萄球菌菌液備用。

1.2.3 待檢樣品的制備

用無菌移液管移取9 mL鮮奶加入1 mL濃度為1.5×107mL-1金黃色葡萄球菌菌液，制備成1.5×106m L-1的金黃色葡萄球菌污染的牛奶樣品，以同樣的方法制備1.5×105mL-1的金黃色葡萄球菌污染的牛奶樣品。

用無菌的移液管分別移取5 mL上述金黃色葡萄球菌污染的牛奶樣品置于3支無菌頂空進樣瓶中，同時用另1支無菌移液管分別移取5 mL無菌鮮牛奶置于3支無菌頂空進樣瓶中作為空白對照?？瞻讓φ沼?℃保存，菌液污染的牛奶均在37℃下培養(yǎng)24 h，然后一起進行HS-SPME/GC-MS測定。

1.2.4 分析條件

色譜條件：進樣口溫度270℃，分流比10∶1，載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，升溫程序：40℃保持3 min，5℃/min升到150℃，10℃/min升到250℃，保持5 min，整個程序40 min。質譜條件：EI離子源，離子源溫度：280℃，傳輸線溫度：280℃，掃描質量范圍：45～500 amu。

2 結 果

2.1 鮮奶無菌檢驗結果

鮮奶樣品經兩次接種培養(yǎng)后，在營養(yǎng)瓊脂平板上無菌落生長，表明鮮奶中無金黃色葡萄球菌污染。

2.2 揮發(fā)性代謝產物分析

在上述檢測條件下，綜合各成分響應強度最高，空白鮮奶和金黃色葡萄球菌污染的鮮奶的揮發(fā)性物質的色譜如圖1和圖2所示。

圖1 空白鮮奶揮發(fā)性物質色譜

圖2 金黃色葡萄球菌污染的鮮奶揮發(fā)性物質色譜

由圖1和圖2可以看出，在空白鮮奶和金黃色葡萄球菌污染的鮮奶的圖譜中，峰數量和峰面積均有較大差異，表明被金黃色葡萄球菌污染的鮮奶組的揮發(fā)性物質與空白鮮奶組相比，發(fā)生了較大變化。

應用NIST MSSearch 2.0質譜數據庫的質譜數據進行計算機檢索比對，并對檢索結果進行解析，結果如表1所示。

由表1可以看出，空白鮮牛奶組鑒定出共同揮發(fā)性物質11個，其中醇類2個、酮類4個、醛類1個、烷烴類2個、烯烴類1個、酚類1個；葡萄球菌污染的牛奶組鑒定出共同揮發(fā)性物質11個，其中酸類5個、酮類3個、醇類1個、烷烴類1個、酚類1個；兩組共同的揮發(fā)性物質有5個，分別是2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、正十四烷、2,6-二叔丁基對甲酚；空白鮮牛奶組特有的揮發(fā)性物質有6個，分別為2-十六醇、2-戊酮、異辛醇、壬醛、3-甲基十三烷、角鯊烯；葡萄球菌污染的牛奶組特有的揮發(fā)性物質有6個，分別是L-2-氨基丁酸、丁酸、異戊酸、2-壬醇、正辛酸、正癸酸。

表1 空白鮮奶和金黃色葡萄球菌污染的鮮奶的揮發(fā)性物質

3 結果與討論

本研究空白鮮牛奶組共鑒定出共同揮發(fā)性物質11個，葡萄球菌污染的牛奶組鑒定出共同揮發(fā)性物質11個。周超等應用HS-SPME/GC-MS分析了空白鮮牛奶和大腸桿菌污染的鮮牛奶的揮發(fā)性代謝產物，結果空白對照組中鑒定出揮發(fā)性物質17種[5]，本試驗空白對照組的物質種類與前述研究中有差異，可能與使用的檢測儀器及奶源不同等有關。另外，本試驗中空白鮮奶組未檢測到酸的成分，在葡萄球菌污染的牛奶組檢測到了5種酸類物質，可能與鮮奶被病原微生物污染后容易發(fā)生酸敗有關。

頂空技術（HS）通過將樣品放入密閉的體系中加熱，使其內部揮發(fā)性成分進入氣相，根據氣相和液相中成分的比值關系，間接得到其在樣品中的含量[6-7]，該方法采用氣體直接進樣的方式，消除大部分樣品對檢測的干擾和色譜柱的污染，同時免去了一系列樣品前處理程序，大大簡化了樣品處理步驟。頂空固相微萃取是固相微萃取的一種[8]，該技術特別適用于平衡態(tài)下易揮發(fā)性有機化合物的檢測，且可以避免樣品中其他成分對萃取效果的影響，具有很好的可重復性，近年來在食品香氣成分分析、藥物檢測和環(huán)境監(jiān)測等領域的應用越來越廣泛[9-11]。牛奶作為人們的日常消費品，其營養(yǎng)物質豐富，易于被機體吸收，是一種優(yōu)質的健康食品。但是在奶牛發(fā)生乳房炎或在擠奶、保存及運輸過程中牛奶很容易被金黃色葡萄球菌污染[12-13]，而一旦有微生物的污染，牛奶的性狀和氣味極易發(fā)生變化。因此，HS-SPME/GC-MS技術鑒別新鮮牛奶和微生物污染的牛奶具有非常大的優(yōu)越性，本試驗研究可為快速鑒別金黃色葡萄球菌污染的鮮奶提供理論依據。