何明會(huì), 曾麗蘭, 黨笑笑, 楊詩雯, 張勇民, 董登祥*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550000； 2. 漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000；3. 西安解碼生物科技有限公司，陜西 西安 710000； 4. 重慶市巫山縣中醫(yī)院，重慶 404700；5. 法國索邦大學(xué) 法國國家科研中心，巴黎 75005)

白樺脂酸(betulinic acid, Chart 1)是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，為白樺脂醇的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于白樺樹、夏枯草、光皮木瓜、迷迭香、酸棗仁等植物中，但含量較低，即使是在白樺樹的樹皮中，含量也僅為千分之二左右[1-2]。白樺脂酸具有抗腫瘤[3-4]、抗HIV[5-8]、調(diào)血脂[9-10]、抗糖尿病[11]等多種藥理活性。大多數(shù)五環(huán)三萜類化合物都具有抗炎作用，如甘草次酸、齊墩果酸等，因此白樺脂酸也具有抗炎作用[12-13]。與傳統(tǒng)化療藥物相比，白樺脂酸衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，能有效抑制其生長，且毒副作用小，可通過多種作用機(jī)制直接發(fā)揮抗腫瘤作用或與其他抗腫瘤藥聯(lián)合用藥，通過增強(qiáng)療效或降低毒副作用等方式間接起到抗腫瘤作用[14-16]。

Chart 1

白樺脂酸是一種具有很高研究價(jià)值的天然化合物，具有良好的抗腫瘤和抗HIV活性，特別是對(duì)黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞，有很高的生物活性而對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞無損害[17]。目前，對(duì)白樺脂酸的開發(fā)利用不多，制劑種類也比較單一，并且水溶性低、生物利用度不高、口服難吸收等因素也使其未應(yīng)用于臨床。為了改善白樺脂酸的水溶性和生物利用度，人們進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和衍生物的合成，旨在獲得高效、低毒且藥理活性顯著的化合物。石瑋、Majeed等[18-19]對(duì)白樺脂酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了具有良好抗癌活性的白樺脂酸三唑衍生物。Gupta等[20]設(shè)計(jì)合成了白樺脂酸的亞芐基衍生物，并對(duì)5種腫瘤細(xì)胞的毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在C2位進(jìn)行修飾后，其抗腫瘤活性明顯增加，C2位是修飾的有利位點(diǎn)。

天然產(chǎn)物與糖片段連接后，可提高天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度[21-22]。天然產(chǎn)物與糖片段通過糖苷鍵或其他化學(xué)鍵偶連后，由于連接部位不同其生物活性也可能不同。另外，糖具有許多不同的藥理作用，其生物學(xué)功能差不多涵蓋了所有的生物活性譜[23]。因此，用糖片段對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾對(duì)天然產(chǎn)物新藥的研發(fā)具有重大意義。

本文在此基礎(chǔ)上，以白樺脂酸苷元為起始原料，對(duì)其28-COOH進(jìn)行甲基化修飾后制得白樺脂酸-28-羧甲酯(1)。分別以D-半乳糖、D-氨基葡萄糖等為起始原料，通過對(duì)糖羥基保護(hù)與去保護(hù)，得到一系列單糖、二糖片段。通過三氯乙酰亞胺酸酯途徑合成的糖片段對(duì)1的3-位羥基進(jìn)行修飾，合成了3種新型的白樺脂酸糖苷化衍生物(2～4, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和MS(ESI)表征。采用MTT法測試了2～4對(duì)人肺癌細(xì)胞(A549)的體外抑制活性。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WFH-203B型三用紫外分析儀；INOVA-400/500 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FINNI ANLACQ-DECA型質(zhì)譜儀。

D-半乳糖、D-氨基葡萄糖、α-乳糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；白樺脂酸對(duì)照品，中國藥品生物制品檢定所；2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-O-D-吡喃半乳糖三氯乙酰亞胺酸酯(a)， 3,4,6-三-O-乙酰基-2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(c)， 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-乙?；?1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(e)，實(shí)驗(yàn)室自制；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)1的合成

稱取白樺脂酸1.0 g于250 mL圓底燒瓶中，加入CH3I 4 mL，四丁基氟化銨(TBFA)167 mg， 5%NaHCO360 mL和20 mL DCM，通入氮?dú)猓瑪嚢柘路磻?yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：環(huán)己烷/乙酸乙酯(Cy/EtOAc)=2/1，V/V， Rf=0.56)。用DCM/H2O萃取，有機(jī)相層用無水MgSO4干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體197.1 mg,收率97.1%, m.p.147～148 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 4.74(d,J=1.90 Hz, 1H, 29-H), 4.60(m, 1H, 29-H), 3.67(s, 3H, OCH3), 3.18(dd,J=11.20 Hz, 5.00 Hz, 1H, 3-H), 3.00(m, 1H, 19-H), 1.73(s, 3H, 30-H), 1.66(m, 1H, 13-H), 1.62(m, 1H, 18-H), 1.60(m, 4H, 2, 16-H), 1.59(m, 2H, 22-H), 1.57(m, 2H, 1-H), 1.54(m, 4H, 12, 15-H), 1.52(m, 2H, 21-H), 1.50(m, 2H, 7-H), 1.39(m, 2H, 11-H), 1.31(m, 1H, 5-H), 1.18(m, 1H, 9-H), 0.97(s, 3H, 26-H), 0.94(s, 6H, 23, 27-H), 0.93(s, 3H, 24-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3， 101 MHz)δ: 176.65(C28), 150.57(C20), 109.56(C29), 78.96(C3), 56.53(C17), 55.31(C5), 51.37(OMe), 51.27(C9), 50.51(C19), 49.42(C18), 42.36(C14), 40.63(C8), 38.84(C13), 38.68(C4), 38.23(C1), 37.16(C10), 36.95(C22), 34.28(C7), 32.15(C21), 30.57(C16), 29.65(C15), 27.38(C2), 25.80(C12), 25.48(C23), 20.85(C11), 19.65(C30), 19.35(C24), 18.27(C6), 16.10(C26), 15.34(C25), 14.69(C27); MS(ESI)m/z: 655.4{[M+Na]+}。

(2)2的合成

稱取化合物a100 mg(0.20 mmol)和1184 mg(0.39 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和攪拌子，無水DCM 10 mL使其充分溶解，抽真空，通入氮?dú)?；將反?yīng)體系于冰水條件下平衡20 min后加入5 μL三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf, 0.026 mmol)，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用適量飽和NaHCO3調(diào)至pH中性，用DCM/H2O萃取，有機(jī)相層用無水MgSO4干燥，過濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體b105 mg，收率33.5%。

稱取化合物b50 mg(0.06 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入MeOH約3 mL，攪拌使其完全溶解。緩慢加入新制MeONa溶液，調(diào)pH至12～13，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=1/3)。加入陽離子交換樹脂調(diào)pH至弱酸性，過濾，減壓濃縮除去甲醇，真空干燥得粗產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化,濃縮,殘余物真空干燥得白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-β-D-吡喃半乳糖基(2)34 mg,收率86.5%, m.p.165～166 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 4.76(dd,J=7.16 Hz, 2.50 Hz, 1H, 1′-H), 4.75(dd,J=1.64 Hz, 1.52 Hz, 1H, 29-H), 4.62(m, 1H, 29-H), 3.73(s, 1H, 2′-H), 3.67(s, 3H, OCH3), 3.67(m, 3H, 3′, 6′-H), 3.66(s, 1H, 5′-H), 3.61(s, 1H, 4′-H), 3.57(m, 1H, 3-H), 3.05(m, 1H, 19-H), 2.09(dd,J=7.51 Hz, 1.46 Hz, 1H, 9-H), 1.82(m, 2H, 22-H), 1.75(m, 1H, 18-H), 1.74(s, 3H, 30-H), 1.70(m, 2H, 16-H), 1.63(m, 1H, 5-H), 1.57(m, 2H, 2-H), 1.52(m, 4H, 6, 15-H), 1.51(m, 2H, 21-H), 1.42(m, 2H, 7-H), 1.39(m, 5H, 11, 12, 13-H), 1.36(m, 2H, 1-H), 0.98(s, 3H, 23-H), 0.93(s, 6H, 24, 26-H), 0.91(s, 3H, 27-H), 0.81(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)δ: 176.63(C28), 149.79(C20), 110.20(C29), 106.18(C1′), 91.96(C3), 78.45(C5′), 78.43(C3′), 75.54(C2′), 71.28(C4′), 62.83(C6′), 56.55(C5), 56.06(C17), 51.37(OMe), 51.29(C9), 49.94(C19), 49.22(C18), 42.98(C14), 42.34(C8), 40.66(C13), 39.20(C1), 39.86(C22), 38.95(C4), 37.76(C10), 32.89(C7), 31.72(C21), 29.71(C16), 29.69(C15), 26.06(C12), 25.89(C2), 22.07(C23, C24), 21.24(C11), 19.44(C30), 18.75(C6), 15.99(C26), 15.90(C25), 14.76(C27); MS(ESI)m/z: 655.4{[M+Na]+}。

(3)3的合成

稱取化合物c100 mg(0.17 mmol)和181 mg(0.17 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和無水DCM 10 mL，攪拌使其充分溶解；抽真空，通入氮?dú)?；將反?yīng)體系于冰水條件下平衡20 min后加入6 μL TMSOTf(0.026 mmol)，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用適量飽和NaHCO3溶液調(diào)至pH中性，用DCM/H2O萃取，有機(jī)相層用無水MgSO4干燥，過濾，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)純化得白色固體d58 mg，收率37.9%。

稱取化合物d50 mg(0.06 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入2 mL AC2O(0.02 mmol)和2 mL MeOH，通入氮?dú)猓瑪嚢柘路磻?yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：DCM/MeOH=8/1)。減壓蒸除溶劑，殘余物用MeOH溶解，過濾，濾液減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：DCM/MeOH=10/1)純化，濃縮，殘余物用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化，濃縮后干燥得黃白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-(2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-D-吡喃葡萄糖基)(3)47 mg,收率88.2%, m.p.183～184 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.08(d,J=9.11 Hz, 1H, N-H), 4.96(d,J=18.20 Hz, 1H, 29-H), 4.76(dd,J=6.93 Hz, 2.59 Hz, 1H, 1′-H), 4.65(m, 1H, 29-H), 3.89(s, 1H, 2′-H), 3.83(s, 1H, 3′-H), 3.66(s, 2H, 6′-H), 3.65(s, 3H, OCH3), 3.65(dd,J=7.70 Hz, 3.39 Hz, 1H, 5′-H), 3.57(s, 1H, 4′-H), 3.56(m, 1H, 3-H), 2.80(m, 1H, 19-H), 2.77(dd,J=7.33 Hz, 6.04 Hz, 1H, 18-H), 1.98(s, 3H, N-CH3), 1.91(m, 6H, 2, 16, 22-H), 1.73(s, 3H, 30-H), 1.72(m, 1H, 13-H), 1.63(m, 8H, 6, 7, 15, 21-H), 1.54(m, 4H, 11, 12-H), 1.279m, 2H, 1-H), 1.19(m, 1H, 5-H), 1.15(m, 1H, 9-H), 0.96(s, 3H, 23-H), 0.92(s, 6H, 24, 26-H), 0.85(s, 3H, 27-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3, 126 MHz)δ: 175.30(C28), 150.00(C20), 107.00(C29), 99.18(C1′), 77.21(C3), 74.65(C2′), 71.43(C3′), 67.23(C4′), 65.55(C6′), 51.37(OMe), 50.20(C5′), 49.55(C5), 48.91(C17), 48.53(C9), 42.84(C14), 39.67(C8), 38.84(C19), 38.00(C18), 35.11(C13), 33.05(C4), 30.21(C10), 29.89(C7), 28.38(C1), 26.69(C15), 24.46(C16), 24.36(C12), 23.89(C2), 21.14(C11), 20.62(C21), 19.47(C23, C24), 19.44(C30), 18.35(C6), 18.31(C26), 18.21(C25), 18.10(C27); MS(ESI)m/z: 696.5{[M+Na]+}。

(4)4的合成

稱取化合物e100 mg(0.13 mmol)和1120 mg(0.25 mmol)加入100 mL圓底燒瓶中，加入分子篩和攪拌子，無水DCM 10 mL使其充分溶解，抽真空，通入氮?dú)?；將反?yīng)體系于冰水條件下平衡20 min后加入5 μL TMSOTf(0.026 mmol)，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=2/1)。用飽和NaHCO3溶液調(diào)至pH中性，DCM/H2O萃取，有機(jī)相層用無水MgSO4干燥，過濾，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：Cy/EtOAc=3/1)，純化得白色固體f25 mg，收率17.9%。

稱取化合物f50 mg(0.05 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入MeOH約4 mL，攪拌使其完全溶解。緩慢加入新制MeONa溶液，調(diào)pH至12～13，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測，展開劑：Cy/EtOAc=1/3)。加入陽離子交換樹脂調(diào)PH至弱酸性，過濾，濾液減壓濃縮除去甲醇，真空干燥得粗產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱(洗脫劑：MeOH)純化，濃縮后真空干燥得白色固體白樺脂酸-28-羧甲酯-3-O-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→ 4)-D-吡喃葡萄糖基](4)25 mg, 收率68.5%, m.p.245～247 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 4.90(d,J=15.64 Hz, 1H, 29-H), 4.79(dd,J=7.90 Hz, 2.37 Hz, 1H, 1″-H), 4.67(d,J=11.26 Hz, 1H, 29-H), 4.64(dd,J=3.45Hz , 2.89 Hz, 1H, 1′-H), 3.87(s, 1H, 5′-H), 3.84(s, 1H, 3′-H), 3.81(s, 1H, 2′-H), 3.76(m, 4H, 6′, 6″-H), 3.75(s, 1H, 2″-H), 3.70(s, 1H, 4′-H), 3.68(s, 3H, OCH3), 3.65(s, 1H, 5″-H), 3.64(s, 1H, 3″-H), 3.61(m, 1H, 3-H), 3.60(s, 1H, 4″-H), 2.86(dd,J=7.33 Hz, 6.04 Hz, 1H, 18-H), 2.05(m, 1H, 13-H), 1.95(m, 1H, 19-H), 1.78(m, 2H, 2-H), 1.75(s, 3H, 30-H), 1.70(m, 4H, 21, 22-H), 1.63(m, 8H, 6, 7, 15, 16-H), 1.55(m, 2H, 11, 12-H), 1.50(m, 2H, 1-H), 1.39(m, 1H, 9-H), 1.32(m, 1H, 5-H), 0.98(s, 3H, 23-H), 0.93(s, 3H, 24-H), 0.92(s, 3H, 26-H), 0.86(s, 3H, 27-H), 0.82(s, 3H, 25-H);13C NMR(CDCl3, 101 MHz)δ: 176.59(C28), 149.79(C20), 110.20(C29), 106.12(C1′), 104.12(C1″), 83.14(C3), 79.64(C4′), 77.46(C5″), 77.43(C3′), 76.79(C3″), 76.78(C5′), 75.07(C2′), 73.99(C2″), 71.26(C4″), 62.44(C6″), 61.42(C6′), 56.52(C5), 56.07(C17), 51.27(C9), 49.94(C19), 49.22(C18), 42.98(C14), 42.31(C8), 40.63(C4), 39.52(C13), 39.02(C1), 36.79(C10), 35.46(C22), 31.90(C21), 29.68(C15), 27.74(C12), 25.67(C2), 23.92(C23), 23.67(C24), 22.67(C11), 19.43(C30), 18.97(C6), 16.40(C26), 16.15(C25), 15.93(C27); MS(ESI)m/z: 817.4{[M+Na]+}。

1.3 生物活性測試

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組，其中空白對(duì)照組為A549培養(yǎng)基，由90%F～12K無血清培養(yǎng)液和10%胎牛血清新配而成，阿霉素為陽性對(duì)照組，化合物2～4為實(shí)驗(yàn)組。取對(duì)數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞，以3×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度，每孔按100 uL細(xì)胞懸液隨機(jī)平行接種到96孔板內(nèi)，孵育24 h后，接種藥物。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)后加入含有不同藥物濃度(1×10-3mmol/L， 1×10-4mmol/L， 1×10-5mmol/L， 1×10-6mmol/L)的新鮮培養(yǎng)基。每組6個(gè)復(fù)孔，分別孵育24 h后每孔加入10 uL MTT溶液(濃度為5 mg/mL)，在5%CO2的恒溫孵育箱中繼續(xù)孵育24 h。吸去上清液，每孔加入200 uL DMSO，振蕩10 min。用酶標(biāo)儀測定波長570 nm處吸光值，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

采用三氯乙酰亞胺酸酯途徑合成3個(gè)白樺脂酸糖苷化衍生物。其原因在于亞胺酯合成法收率高，但其基團(tuán)又容易失活，即合成三氯乙酰亞胺酸酯時(shí)，1-位的半縮醛OH被CNCCl3保護(hù)后，對(duì)質(zhì)子酸較敏感，得到的產(chǎn)物穩(wěn)定性差，必須及時(shí)使用。

合成白樺脂酸與糖片段時(shí)，在室溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)率低，而在低溫時(shí)，由于乙酰亞胺酯形成碳正離子速度減慢，與白樺脂酸苷元的羥基結(jié)合幾率明顯增加，因此實(shí)驗(yàn)選擇在冰水浴條件下進(jìn)行反應(yīng)。

2.2 抗腫瘤活性

表1為目標(biāo)化合物對(duì)A549的體外抑制活性。由表1可知，白樺脂酸C28位甲基化后，在C3位接入單糖和二糖片段得到的糖苷化衍生物(2～4)在不同濃度下對(duì)A549細(xì)胞均具有抑制活性，但均略低于阿霉素，其中化合物4在濃度1×10-3mmol·L-1時(shí)抑制率最高，達(dá)到(91.07±0.18)%，而化合物2、3在濃度1×10-3mmol·L-1時(shí)，抑制率也超過70%。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)A549的體外抑制率

合成了3種新型白樺脂酸糖苷化衍生物，并采用MTT法初步評(píng)價(jià)了化合物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的體外抑制活性。結(jié)果表明，白樺脂酸結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾后，其抗腫瘤活性均有所提高，雖然略低于陽性對(duì)照組阿霉素，但也初步解決了白樺脂酸水溶性差、生物活性低等難題，為今后白樺脂酸的結(jié)構(gòu)修飾和衍生物的開發(fā)利用提供了依據(jù)。