張 蕙，周曉梅，張 彪，孫 曉，李文杰, ，李拖平

（1.吉林師范大學(xué)博達(dá)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林四平 136000；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；3.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林四平 136000；4.沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110011）

蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase）屬于糖基水解酶第13家族，是催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的特異性酶，能催化蔗糖發(fā)生磷酸解作用，生成1-磷酸葡萄糖（glucose-1-phosphate, Glc1P）和D-果糖以及其逆反應(yīng)[1?2]。由于該催化特性，SPase長(zhǎng)期以來(lái)一直用于生產(chǎn)Glc1P。此外，SPase結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有廣泛的底物特異性，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域上均有廣泛的應(yīng)用,如可催化半乳糖、鼠李糖、果糖等物質(zhì)合成不同的低聚糖；修飾和改造含有醇羥基、酚羥基及羧基的化合物；或可以將曲酸糖苷化、催化氫醌合成熊果苷等[3?5]；也可以用于合成某些不穩(wěn)定物質(zhì)的衍生物，如將葡糖基轉(zhuǎn)移到抗壞血酸上，使其穩(wěn)定性和水溶性得到提升[6]。

SPase主要存在于乳酸菌和雙歧桿菌中，有利于其能量代謝[7]。Kagan等[8]首次從Leuconostoc mesenteroides中發(fā)現(xiàn)SPase后，研究人員相繼從不同的微生物中發(fā)現(xiàn)了該酶,如Pseudomonas saccharophila[9?10]、Stococcus mutans[11]、Bifidobacterium adolescentis[12]等。但通過(guò)野生菌株發(fā)酵獲得的SPase產(chǎn)率較低，難以滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。所以，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組SPase工程菌，實(shí)現(xiàn)該酶的高效表達(dá)是一條合理且有利的途徑。常用于構(gòu)建重組SPase工程菌的菌株有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，如E. coliRosetta（DE3）、E. coliBL21、B.subtilisWS11等[13?14]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于重組SPase工程菌的研究大多是工程菌的構(gòu)建、應(yīng)用、固定化、酶學(xué)性質(zhì)分析和表達(dá)條件的優(yōu)化等[15?20]，但幾乎沒(méi)有對(duì)重組SPase表達(dá)培養(yǎng)基成分優(yōu)化的研究。同時(shí)，化學(xué)試劑對(duì)SPase的影響直接關(guān)乎到該酶的貯存和使用，而這方面的研究也少之又少。因此，本文對(duì)來(lái)源于雙歧桿菌的SPase基因的重組菌株E. coliBL21/pET30-SPase表達(dá)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了優(yōu)化，研究了不同的培養(yǎng)基成分對(duì)SPase表達(dá)的影響，并探究了常見(jiàn)化學(xué)試劑和金屬離子化合物對(duì)該酶活性的影響，以期為SPase的高效生產(chǎn)提供理論與技術(shù)的支撐條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組菌E. coliBL21/pET30-SPase 由本實(shí)驗(yàn)室保存。其中，SPase基因克隆自Bifidobacterium longumJCM 1217（AB303838），與載體pET-30連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中[21]；蛋白分子量Marker 北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半 乳 糖 苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase，PGM，100 U/mg）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，150 U/mg）、1,6-二磷酸葡萄糖（Glucose-1,6-diphosphate，Glc 1,6-bP） 上海瑞永生物科技有限公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；LB培養(yǎng)基 按文獻(xiàn)配制[5]。

HNY-21恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SLPe超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 廣州中善儀器儀表有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌E. coliBL21/pET30-SPase的表達(dá)從LB固體平板上挑取單菌落接種于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量接種于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)20 h[22]。

1.2.2 SPase粗酶液的制備及純化 將目的菌培養(yǎng)液離心（4 ℃、10000 r/min、10 min），收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌兩次沉淀。然后，超聲破碎細(xì)胞（超聲3 s、間歇5 s、共3 min，功率100 W），4 ℃、15000 r/min離心30 min得到粗酶液（上清液）。使用Ni-NTA柱以含60 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH7.0）對(duì)粗酶液進(jìn)行洗脫純化得到目標(biāo)蛋白。

1.2.3 SPase的酶活性測(cè)定 將150 μL酶液和150 μL蔗糖溶液（10 mmol蔗糖、50 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0）在30 ℃反應(yīng)30 min后，立即煮沸滅活10 min。加入300 μL反應(yīng)液在30 ℃中反應(yīng)30 min，然后在340 nm處測(cè)定吸光度值。反應(yīng)液為2.5 U/mL PGM、2 U/mL G6PDH、20 μmol/L Glc 1,6-bP、2 mmol/L NADP+、10 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MOPS緩沖液（pH7.0）[23?24]。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=2.1387x（R2=0.9992）計(jì)算酶與底物反應(yīng)過(guò)程中生產(chǎn)的Glc1P。

酶活性定義為：在30 ℃、pH7.0條件下，以蔗糖為底物，每分鐘產(chǎn)生1 μmol的Glc1P所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

總酶活（U）為50 mL培養(yǎng)基中的總酶活。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定及SDS-PAGE分析 以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。SDS-PAGE采用12%濃縮膠和5%分離膠進(jìn)行電泳，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色?？偟鞍祝╩g）為50 mL培養(yǎng)基中蛋白的總量。

1.2.5 培養(yǎng)基成分的篩選 以50 mL LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，并作為空白對(duì)照，將不同的碳源、氮源、穩(wěn)定劑、金屬離子分別加入到LB培養(yǎng)基中，按1.2.1方法培養(yǎng)。以總蛋白和總酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察其對(duì)SPase表達(dá)的影響。根據(jù)參考文獻(xiàn)[25?27]確定實(shí)驗(yàn)方案如下：在考察碳源對(duì)SPase表達(dá)的影響時(shí)，分別向LB培養(yǎng)基中添加的碳源為0.5%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%蔗糖和0.5%丙三醇；在考察氮源對(duì)SPase表達(dá)的影響時(shí)，分別向LB培養(yǎng)基中添加的氮源為0.5%NaNO3、0.5%NH4Cl、0.5%（NH4）2SO4和0.5%尿素；在考察穩(wěn)定劑對(duì)SPase表達(dá)的影響時(shí)，分別向LB培養(yǎng)基中添加的穩(wěn)定劑為0.1%BSA、0.1%精氨酸、0.1%維生素C和0.1%FeCl2；在考察金屬離子對(duì)SPase表達(dá)的影響時(shí)，分別向LB培養(yǎng)基中添加的金屬離子為0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.1%CuSO4和0.1%ZnCl2。

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)重組SPase的表達(dá)有顯著性提高的因素，并根據(jù)現(xiàn)有的相關(guān)研究中較優(yōu)的因素水平[25?27]確定正交試驗(yàn)的因素水平（表1）。以淀粉、K+和Mg2+為變量因子，以總酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，研究三種培養(yǎng)基成分的協(xié)調(diào)作用對(duì)SPase表達(dá)的影響。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 化學(xué)試劑對(duì)重組SPase酶活性的影響 依據(jù)參考文獻(xiàn)[28]的方法，向純化的重組SPase酶液中分別加入不同的化學(xué)試劑或金屬離子化合物，考察其對(duì)重組SPase酶活性的影響。分別加入0.1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、SDS；1 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2；10 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在30 ℃下保溫1 h，測(cè)定其酶活。以未經(jīng)試劑處理的酶液作為對(duì)照，酶活設(shè)定為100%，計(jì)算處理后的相對(duì)酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中的每組實(shí)驗(yàn)均平行三次，采用Excel 2010軟件制圖，應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)的方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源和氮源對(duì)重組SPase表達(dá)的影響

碳源和氮源是培養(yǎng)基的重要組成部分，是微生物生長(zhǎng)代謝的能量來(lái)源和物質(zhì)基礎(chǔ)，與目的蛋白的表達(dá)有著密切的聯(lián)系[29]。對(duì)培養(yǎng)基中碳源的研究結(jié)果如圖1a所示，向LB培養(yǎng)基中添加0.5%可溶性淀粉可顯著提高SPase的總酶活和總蛋白含量（P＜0.05），而蔗糖和丙三醇的添加雖然提高了蛋白的表達(dá)量，但其酶活性極顯著降低（P＜0.01），推測(cè)這可能是由重組蛋白的高水平表達(dá)易形成無(wú)活性的包涵體[30]。氮源對(duì)SPase表達(dá)的影響如圖1b所示，實(shí)驗(yàn)所用的四種氮源中，NaNO3對(duì)目的蛋白表達(dá)無(wú)顯著的影響（P＞0.05），其余三種氮源均較為明顯的抑制了SPase蛋白的表達(dá)。并且，通過(guò)總蛋白含量和總酶活所表現(xiàn)的不同氮源和碳源對(duì)蛋白表達(dá)的影響與SDSPAGE分析結(jié)果（圖1c）相一致（目的蛋白的分子量為56.51 kDa）。

圖1 碳源和氮源對(duì)重組SPase表達(dá)的影響Fig.1 Effects of carbon and nitrogen sources on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

2.2 穩(wěn)定劑和金屬離子對(duì)重組SPase表達(dá)的影響

穩(wěn)定劑除了可以影響酶的活性和穩(wěn)定性以外，對(duì)微生物的生長(zhǎng)也具有一定的影響效應(yīng)[31]。如圖2a所示，四種穩(wěn)定劑對(duì)重組SPase在大腸桿菌中的表達(dá)均起到了抑制作用，SDS-PAGE分析（圖2b）也顯示了同樣的結(jié)果。其中，維生素C和FeCl2極顯著（P＜0.01）抑制了蛋白的表達(dá)，這可能是由于維生素C和FeCl2抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)，從而使菌密度和SPase的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致總蛋白和總酶活較低。

圖2 穩(wěn)定劑和金屬離子對(duì)重組SPase表達(dá)的影響Fig.2 Effects of stabilizers and metal ions on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

金屬離子是微生物生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)物合成中的重要輔助因子，作為其生理活性物質(zhì)的組成或生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)物，對(duì)酶的活性具有一定的激活作用[32]。由圖2c可知，培養(yǎng)基中添加0.1% K+或Mg2+均提高了SPase的總酶活和總蛋白含量，促進(jìn)了大腸桿菌的生長(zhǎng)及SPase的表達(dá)。而Cu2+和Zn2+的添加則完全抑制了菌體的生長(zhǎng)和SPase的表達(dá)。這可能是由于Cu2+和Zn2+的金屬毒性較強(qiáng)，當(dāng)其與微生物接觸后，會(huì)破壞微生物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使微生物體內(nèi)的一系列生化反應(yīng)發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致了微生物的死亡[33]。同時(shí)SDS-PAGE的分析（圖2d）結(jié)果也支持了總酶活和總蛋白含量的測(cè)定結(jié)果，可明顯的看出K+或Mg2+處理的目標(biāo)蛋白條帶較粗。

2.3 培養(yǎng)基最優(yōu)組成的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2、表3可知，在三個(gè)因素中對(duì)SPase表達(dá)影響的大小順序?yàn)镃＞B＞A，即Mg2+的添加量對(duì)SPase表達(dá)的影響表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01），K+和淀粉的添加量對(duì)SPase表達(dá)的影響表現(xiàn)為顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B2C1，即淀粉的添加量為0.5%、K+的添加量為0.1%和Mg2+的添加量為0.05%。根據(jù)所得最優(yōu)培養(yǎng)基組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，SPase的總酶活平均值達(dá)到1207.83 U，比該酶在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中表達(dá)的總酶活提高了3.6倍，其優(yōu)化結(jié)果在SPase的工業(yè)化生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.4 化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)重組SPase穩(wěn)定性的影響

當(dāng)某些化學(xué)試劑與酶混合后，有可能影響酶的分子結(jié)構(gòu)，近而對(duì)酶的活性產(chǎn)生不同程度的影響[34]。從表4的結(jié)果可以看出，低濃度（0.1%）的吐溫80和高濃度（1%）的BSA對(duì)SPase的活性具有一定的提升作用，這是由于BSA具有穩(wěn)定酶的作用，能有效地保護(hù)酶不被降解，從而促進(jìn)了酶的活性。濃度為0.1%的BSA、丙三醇和山梨醇對(duì)酶活的影響不大；而0.1%的維生素C、SDS，1%的吐溫80、維生素C、SDS、丙三醇和山梨醇對(duì)酶活性有不同程度的抑制作用，這可能是由于其改變了酶的活性中心結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了該酶的活性部分或全部喪失。其中，作為蛋白質(zhì)變性劑的SDS抑制了90%以上的酶活性，因?yàn)镾DS分子上的硫酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面的氨基酸緊密結(jié)合，其分子上的烷基則與蛋白質(zhì)的疏水部分緊密結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)變性失活。吐溫80屬于非離子型表面活性劑，在低濃度時(shí)與酶的疏水活性中心產(chǎn)生相互作用，有利于底物與酶的結(jié)合，從而促進(jìn)酶的活性；在高濃度時(shí)吐溫80與酶的活性中心緊密結(jié)合，使底物無(wú)法進(jìn)入到酶的活性中心，而無(wú)法催化其他化學(xué)反應(yīng)，從而抑制了酶的活性[35]。

表4 化學(xué)試劑對(duì)重組SPase穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of chemical reagents on stability of recombinant SPase

另一方面，金屬離子在酶的催化反應(yīng)過(guò)程中也均有重要的作用，可使底物直接結(jié)合到酶的活性部位,或者通過(guò)可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)從而調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)，或者通過(guò)靜電穩(wěn)定及屏蔽負(fù)電荷等途徑參與酶的催化。國(guó)內(nèi)外已有大量的研究表明，將金屬離子作為激活劑添加到在酶反應(yīng)液中是一種改善酶活性或穩(wěn)定性的行之有效的方法[36?38]。如表5所示，1 mmol/L的Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+均可以影響到SPase的穩(wěn)定性，經(jīng)這些離子處理后的酶活均有不同程度的下降。而較高濃度（10 mmol/L）的Fe2+和Mg2+則對(duì)SPase的活性和穩(wěn)定性表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用。

表5 金屬離子對(duì)重組SPase穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of metal ions on stability of recombinant SPase

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然作為碳源的淀粉和無(wú)機(jī)離子K+和Mg2+對(duì)SPase的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用，但三者的協(xié)同作用是重組SPase工程菌（E.coliBL21/pET30-SPase）高效表達(dá)SPase的優(yōu)選條件，可以在很大程度上提高SPase的表達(dá)效率。其中，在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.5%淀粉、0.1% K+和0.05% Mg2+的組合，可提高到3.6倍的表達(dá)效率。與現(xiàn)有的重組SPase表達(dá)優(yōu)化研究相比，該優(yōu)化方式提高目的蛋白表達(dá)的水平較高，在SPase的工業(yè)化生產(chǎn)上具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。另外，通過(guò)一些適當(dāng)濃度的表面活性劑如吐溫80，或一些金屬離子如Fe2+和Mg2+可以對(duì)重組SPase的活性起到一定的促進(jìn)作用，對(duì)該酶的高效利用提供了理論依據(jù)，也為日后進(jìn)一步研究該酶的性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。但本試驗(yàn)也存在不足之處，在粗酶液的制備過(guò)程中存在影響酶活的操作，如細(xì)胞破碎。因此，在日后的科研工作中，將對(duì)此類操作步驟進(jìn)行優(yōu)化，以期進(jìn)一步提高該酶的活性。