董寅壯, 王 堽, 何敏敏, 耿 貴,2

(1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150080; 2.黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 哈爾濱 150080)

0 引 言

水分、溫度、鹽度和營養(yǎng)元素等非生物脅迫會十分顯著地影響植物的生長發(fā)育[1]。鐵元素(Fe)對于植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，一定濃度范圍內(nèi)的鐵元素對于植物的生長發(fā)育起促進(jìn)作用。地殼中鐵元素的豐度很高，其在全球土壤中也有廣泛的分布，但主要都是以三價鐵形式、氫氧化物、磷酸鹽、氧化物或其他沉淀的化合物等難溶于水的形態(tài)存在[2]，能被植物吸收利用的二價鐵只占土壤總鐵含量的一小部分[3]。在一些低洼地區(qū)或酸性土壤中，植物根際土壤環(huán)境會形成還原性較強(qiáng)的有機(jī)酸，導(dǎo)致土壤中以游離態(tài)形式存在的Fe2+濃度過高，從而影響植物的生長發(fā)育[4]。

大多數(shù)植物體內(nèi)的鐵含量為100～300 mg·kg-1[5]，鐵元素主要分布于細(xì)胞液泡、葉綠體以及許多鐵蛋白中，它參與植物體內(nèi)許多代謝過程，包括光合作用、葉綠素的生物合成、酶的活性和呼吸作用等[6]。高濃度的Fe2+會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生顯著的抑制作用[7]，植物干重中的鐵超過一定數(shù)量就被認(rèn)為是鐵中毒[8]。研究發(fā)現(xiàn)，過量Fe2+脅迫不僅會導(dǎo)致豌豆幼苗的氣孔抑制，而且會直接傷害其光合反應(yīng)機(jī)構(gòu)[9]；水稻在過量Fe2+脅迫下，其細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量顯著下降，植株內(nèi)的其他元素如P、N、K和Zn等的含量也會受到影響[10]。當(dāng)前在植物應(yīng)對低鐵脅迫機(jī)制方面的研究較多，也較為透徹，但是在植物應(yīng)對高鐵脅迫機(jī)制方面的研究較少，尤其是高鐵脅迫對于甜菜光合特性影響機(jī)制的研究十分有限。本研究以甜菜為研究材料，探究了高鐵脅迫對于其生長及光合特性的影響。

甜菜是黎科，甜菜屬，二年生草本植物，其塊根中的蔗糖含量高達(dá)15%～20%[11]，是目前我國甚至全世界都十分重要的糖料作物之一，其在我國是僅次于甘蔗的第二大糖料作物[12]。甜菜生長需要磷、鉀、氮、鈉、錳和鐵等不同的營養(yǎng)元素，鐵元素對于甜菜的生長、產(chǎn)量和糖分累積起著十分重要的作用[13]。目前，我國甜菜主產(chǎn)區(qū)尤其是東北一些地區(qū)土壤pH較低，易于二價鐵的積累。另外，一些地區(qū)夏季澇害同樣會造成二價鐵濃度的升高，這些都會成為甜菜種植的障礙。本文通過研究高鐵脅迫對甜菜幼苗生長指標(biāo)、光合特性和脂膜通透性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，探究非生物脅迫對植物生理的損傷機(jī)制，為后續(xù)研究以及高二價鐵條件下的甜菜種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本試驗于2020年10月在黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院光照培養(yǎng)室進(jìn)行，“KWS1176”甜菜種子購自德國KWS公司。將種子置于蛭石中加適量水，于光照培養(yǎng)室內(nèi)使種子萌發(fā)，至子葉完全展開(7 d)后，將萌發(fā)一致的幼苗轉(zhuǎn)移栽至2.5 L水培槽中，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，其中Fe2+以Fe(Ⅱ)-EDTA形態(tài)存在。光培室內(nèi)溫度保持在晝夜(28±2) ℃和(20±2) ℃，光照條件為450 μmol·(m2·s)-1，14 h/10 h(光照/黑暗)，相對濕度保持60%～70%。6 d后將幼苗移至Fe2+濃度分別為0.12、0.24、0.48、0.96、1.92和3.84 mmol·L-1的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，對照組為1/2 Hoagland營養(yǎng)液(Fe2+濃度0.06 mmol·L-1)培養(yǎng)的幼苗。每個處理設(shè)置6個重復(fù)，培養(yǎng)期間水培槽內(nèi)24 h通氣，每7 d更換一次培養(yǎng)液，幼苗處理14 d后收獲，測定甜菜幼苗生物量、葉片光合色素含量、光合特性、膜脂通透性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度等幼苗生理指標(biāo)。

1.2 生理指標(biāo)的測定

收獲當(dāng)天測定植株株高，之后立即測量植株各部位鮮重和干重；采用乙醇比色法[14]測定葉片光合色素的含量；使用CI-340手持式光合作用測量系統(tǒng)(美國CID公司)測定幼苗第二片真葉氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)和凈光合速率(Pn)；采用硫代巴比妥酸(TBA)法[15]測定丙二醛(MDA)；采用茚三酮比色法[16]測定游離氨基酸。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Microsoft Office Excel 2019收集整理數(shù)據(jù)；用IBM SPSS Statistics 20.0專業(yè)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和Duncan法顯著性檢驗(P<0.05)；用Sigma Plot 14.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗株高的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Fe2+ on plant height of sugar beet seedlings注: 圖中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差大小，不同字母代表處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.1 高鐵脅迫處理對甜菜幼苗生長的影響

2.1.1 高鐵脅迫處理對甜菜幼苗株高的影響

不同濃度的Fe2+對甜菜的株高會產(chǎn)生影響，由圖1可以看出，隨著營養(yǎng)液中Fe2+濃度的不斷提高(0.06～3.84 mmol·L-1)，甜菜幼苗的生長會受到十分明顯的抑制，并達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Fe2+濃度為0.12、0.24、0.48、0.96、1.92和3.84 mmol·L-1的營養(yǎng)液中生長的甜菜幼苗株高分別為13.8、12.5、11.8、10.6、7.3和3.2 cm。與對照組相比，各Fe2+處理組株高分別下降了約7%、16%、20%、28%、51%和78%。

2.1.2高鐵脅迫處理對甜菜幼苗形態(tài)學(xué)與生物量的影響

不同濃度Fe2+對甜菜幼苗形態(tài)學(xué)的影響如圖2所示，對照組(Fe2+濃度為0.06 mmol·L-1)甜菜幼苗的生長狀況最好，隨著Fe2+濃度的不斷增大，株高不斷降低，葉面積下降；幼苗主根長度和須根數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在Fe2+濃度為0.24 mmol·L-1時達(dá)到最大值。Fe2+濃度為1.92和3.84 mmol·L-1時，甜菜幼苗表現(xiàn)出明顯的鐵中毒現(xiàn)象，此時幼苗發(fā)育遲緩，植株矮小，葉片發(fā)黃枯萎。

不同濃度的高鐵脅迫抑制了甜菜幼苗的生長，最終表現(xiàn)在植株的鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量上，如圖3所示。根據(jù)單因素方差分析，除葉柄之外，0.12和0.24 mmol·L-1的Fe2+對幼苗其他部位和整株的鮮重和干重，與對照組相比沒有顯著差異。隨著Fe2+濃度的增加，幼苗的各部位鮮重和干重都有不同程度的下降。3.84 mmol·L-1的Fe2+處理下幼苗整株的鮮重和干重分別下降了89%和92%。可見，高濃度的Fe2+會極大抑制甜菜幼苗的生長。

圖2 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗形態(tài)學(xué)的影響: (a)地上部； (b)根系； (c)第二對真葉

圖3 不同濃度Fe2+下甜菜幼苗各部位干重和鮮重的變化

2.2 高鐵脅迫對甜菜幼苗葉片光合色素含量的影響

不同濃度Fe2+對甜菜幼苗葉片光合色素含量的影響如圖4所示。單因素方差分析表明，不同鐵濃度下生長的幼苗葉片中光合色素的含量差異顯著。從低濃度到高濃度，葉片葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、總?cè)~綠素(Chla+b)和類胡蘿卜素(Caro)均呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢。Chla含量在0.12 mmol·L-1Fe2+時最高，對照組較之略低；Chlb含量在Fe2+濃度0.24、0.48 mmol·L-1兩個處理組和0.96～3.84 mmol·L-1三個處理組之間差異不顯著； Chla+b含量除0.24和0.48 mmol·L-1處理時差異不顯著，其他處理均顯著下降；Caro含量除0.12和0.24 mmol·L-1處理組，其他無顯著差異。

由圖4可知，隨著Fe2+濃度的不斷增大，葉片葉綠素a與葉綠素b的比值(Chla/Chlb)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。單因素方差分析表明，不同處理組之間的Chla/Chlb值存在顯著差異。Fe2+濃度為1.92 mmol·L-1時，Chla/Chlb達(dá)到最大值2.33，較對照組提高約105%， 3.84 mmol·L-1處理組的Chla/Chlb值與對照組相比沒有顯著差異，其他處理組較對照組均有顯著提高；類胡蘿卜素與總?cè)~綠素的比值(Caro/Chla+b)同樣呈先升后降的趨勢，F(xiàn)e2+濃度為0.24 mmol·L-1時數(shù)值最大，0.48、0.96、1.92和3.84 mmol·L-1處理組均顯著低于對照組。

圖4 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗光合色素的影響

2.3 高鐵脅迫對甜菜幼苗光合特性的影響

不同濃度Fe2+對甜菜幼苗光合特性的影響如圖5所示。葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)對植物的光合作用有不同程度的影響。由單因素方差分析可知,0.12 mmol·L-1的Fe2+對甜菜幼苗葉片的Pn、Tr、Gs和Ci與對照組相比沒有顯著差異。隨著Fe2+濃度的不斷升高(0.24～3.84 mmol·L-1)，上述光合特性參數(shù)顯著下降，并在3.84 mmol·L-1達(dá)到最低，與對照組相比Pn、Tr、Gs和Ci在3.8 mmol·L-1時分別下降了約89%、86%、90%和82%。

圖5 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗光合特性的影響

2.4 高鐵脅迫對甜菜幼苗細(xì)胞脂膜透性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

不同濃度Fe2+對甜菜幼苗葉片和根系丙二醛(MDA)含量的影響如圖6所示。由圖可知，不同處理下，甜菜幼苗根部的MDA含量普遍高于其在葉片中的含量。根據(jù)單因素方差分析，MDA在幼苗葉片和根中的含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。幼苗葉片和根的MDA含量在Fe2+濃度0.96 mmol·L-1時達(dá)到最大，并顯著高于其他處理組。該濃度下葉片和根的MDA含量較對照組分別上升了31%和49%。

游離氨基酸是植物體內(nèi)幾種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對于非生物脅迫下植物的自我保護(hù)有著極其重要的意義。不同濃度Fe2+對甜菜幼苗不同組織游離氨基酸含量的影響如圖7所示。由圖可知，不同處理下，幼苗葉片的游離氨基酸含量高于根部積累的游離氨基酸。與MDA類似，游離氨基酸在幼苗體內(nèi)的含量也呈先升高后降低的趨勢，在Fe2+濃度0.96 mmol·L-1時達(dá)到最大值，此時葉片與根內(nèi)的游離氨基酸含量達(dá)到5.88 和2.94 mg·g-1。 隨著Fe2+濃度繼續(xù)增大，游離氨基酸的含量逐漸降低，但均顯著高于對照組。

圖6 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗不同組織MDA含量的影響

圖7 不同濃度Fe2+對甜菜幼苗不同組織游離氨基酸含量的影響

3 討 論

3.1 不同濃度Fe2+處理影響甜菜幼苗生長指標(biāo)的變化

鐵作為植物生長必須的元素，適宜濃度的鐵可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，但是少量或過量鐵元素都會對植物產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。藺冬梅等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度Fe2+脅迫下，豌豆幼苗的根和葉面積急劇下降，脅迫達(dá)到一定程度時，葉片出現(xiàn)壞死斑點[9]。在本研究中，隨著Fe2+濃度的提高，幼苗的株高和生物量指標(biāo)呈現(xiàn)顯著下降趨勢，并且高濃度下的幼苗表現(xiàn)出明顯的鐵中毒特征。幼苗根長和須根數(shù)量隨Fe2+濃度的升高先上升后下降。甜菜通過增大根系面積可以提升對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力以補(bǔ)償高Fe2+對植株生長的抑制，1.92和3.84 mmol·L-1下的幼苗葉面積和根面積急劇下降，表明過高濃度的鐵對植物根系造成了損傷，這與岳麗娟對豌豆的研究結(jié)果一致[17]。

3.2 不同濃度Fe2+處理影響甜菜幼苗光合色素含量的變化

葉綠素對于植物的光合作用起著至關(guān)重要的作用，已經(jīng)證明葉綠素在植株葉片內(nèi)的含量不僅能夠代表該植物的光合作用能力，并且眾多環(huán)境因子的改變也會對其含量造成影響[18]。鐵元素不是葉綠素的組成部分，但對葉綠素的合成十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+處理使甜菜幼苗葉片Chla、Chlb、 Chla+b和Caro含量不同程度降低，這表明高濃度的鐵可能會抑制甜菜葉綠素合成酶的活性或增加葉綠素水解酶的活性，從而使其葉綠素含量下降。葉綠素在植物體內(nèi)是由葉綠素合成前體ALA(δ-氨基酮戊二酸)轉(zhuǎn)化而來的，已有研究表明，ALA的合成與其轉(zhuǎn)化為葉綠素的過程均有鐵元素的參與[19]。由此推斷，可能是高鐵脅迫影響了葉綠素的合成路徑，造成其含量降低。過量金屬元素會與類囊體膜結(jié)合，阻礙Hill反應(yīng)，從而抑制葉綠素的合成[20]；金屬元素取代葉綠素中心鎂離子阻止光的獲取，進(jìn)而造成葉綠素的降解[21]，這也可能是一種高鐵濃度下葉綠素含量降低的機(jī)制。類胡蘿卜素能夠保護(hù)被光激發(fā)的葉綠素免受光氧化脅迫的損傷，可以作為保護(hù)葉綠素的輔助色素，緩解因葉綠素減少而造成的光合作用能力減弱[22]。本研究中，甜菜葉片Caro含量降低可能會進(jìn)一步加劇葉綠素的被破壞程度，進(jìn)而降低幼苗的光合作用能力。

葉綠素a與葉綠素b的比值能夠反映葉綠體中類囊體堆疊的程度，數(shù)值越大說明植物對于光能的利用效率越高[23]。許多研究發(fā)現(xiàn)，Chla/Chlb值會隨著脅迫程度的提高而升高[24-25]，本研究結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。高鐵脅迫下，甜菜葉片Chla/Chlb值會隨著鐵濃度的增加而先升高后降低?？赡茉谔鸩说哪褪芊秶鷥?nèi)，隨著脅迫程度的上升，植株會通過提高光能利用率來緩解高鐵對葉綠素的傷害；但是當(dāng)脅迫程度超出甜菜對鐵的耐受閾值之后，其光合機(jī)構(gòu)被大量破壞，光合能力喪失，所以其Chla/Chlb值急劇下降，甜菜幼苗的凈光合速率Pn也降至最低。此外，類胡蘿卜素與總?cè)~綠素的比值反映脅迫條件下植物的一種保護(hù)機(jī)制，這與植物忍受逆境的能力相關(guān)[26]。本研究中，Caro/Chla+b值隨著Fe2+濃度提高先上升后降低，于0.24 mmol·L-1時達(dá)到最大值。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是，一定程度的鐵脅迫下甜菜會啟動保護(hù)機(jī)制，但對于較高程度的鐵脅迫，保護(hù)機(jī)制能力會變?nèi)趸騿适?，從而加劇鐵對甜菜幼苗光合作用的抑制。

3.3 不同濃度Fe2+處理影響甜菜幼苗光合特性的變化

植物葉片的凈光合速率(Pn)反映其光合作用的強(qiáng)弱。徐玉玲研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Fe2+會導(dǎo)致小麥葉片Pn、Tr、Gs和Ci下降[20]，這與本研究結(jié)果一致。本研究表明，除了0.12 mmol·L-1處理組之外，其他處理組甜菜幼苗葉片的光合特性指標(biāo)均與Fe2+濃度成顯著負(fù)相關(guān)。非生物脅迫下植物Pn的下降可分為非氣孔限制和氣孔限制。氣孔限制方面表現(xiàn)在，隨著幼苗葉片Gs的下降，其光合作用所需的CO2供應(yīng)受到限制，從而導(dǎo)致葉片Pn降低。對于甜菜幼苗Pn的非氣孔抑制，楊穎麗對高鐵脅迫下小麥光合特性的研究發(fā)現(xiàn)[26]，高鐵脅迫下小麥幼苗會發(fā)生光抑制，使PSⅡ活性中心遭受損傷，進(jìn)而導(dǎo)致其激發(fā)能傳遞效率及光合電子傳遞效率降低。藺冬梅的研究也發(fā)現(xiàn)，過量鐵脅迫嚴(yán)重破壞了豌豆幼苗光合電子傳遞途徑，使得光合電子傳遞活性不斷下降，用于光化學(xué)反應(yīng)的能量逐漸減少，而以熱能形式散失掉的光能部分逐漸上升[27]。因此可以推斷，高濃度的Fe2+會降低甜菜葉片細(xì)胞光合PSⅡ活性中心活性與其能量傳遞效率，并且影響其光合電子傳遞效率。正常的蒸騰作用對于維持植株正常形態(tài)、保持細(xì)胞含水量具有重要意義[28]。高鐵脅迫下葉片氣孔關(guān)閉,Gs下降會直接降低其Tr。本研究中，Tr在Fe2+濃度1.92和3.84 mmol·L-1時最小，植株相應(yīng)地在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出最明顯的鐵中毒特征，這是由于該濃度下植株蒸騰作用受阻，細(xì)胞內(nèi)溫度和水分等失衡，導(dǎo)致植株光合系統(tǒng)受損，不能正常進(jìn)行物質(zhì)合成，最終表現(xiàn)在甜菜幼苗的形態(tài)學(xué)特征上。

3.4 不同濃度Fe2+處理影響甜菜幼苗細(xì)胞脂膜透性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

非生物脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的H2O2等活性氧，從而造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其在細(xì)胞內(nèi)的含量能夠反映膜脂的過氧化水平和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的受損害程度。研究表明，不同非生物脅迫都會導(dǎo)致甜菜體內(nèi)的MDA含量上升[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，甜菜幼苗葉片和根系中的MDA含量均隨Fe2+濃度的上升而增加，在0.96 mmol·L-1時達(dá)到最大值，并且根系內(nèi)的MDA含量大于葉片內(nèi)的含量。推測這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是，隨著脅迫程度的提升，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量不斷升高，幼苗體內(nèi)的MDA含量也相應(yīng)提高；水培條件下，根部所處環(huán)境特殊，所受脅迫程度高于地上部。另外，甜菜幼苗通過根部吸收養(yǎng)分，根部細(xì)胞與外界物質(zhì)交換頻繁，這也會在一定程度上增強(qiáng)Fe2+對其脅迫程度，所以根部的MDA含量較葉片高。岳麗娟研究發(fā)現(xiàn)，隨著鐵脅迫程度的提高，豌豆根系部位的鐵含量逐漸升高[17]，這與本研究的結(jié)果一致。Fe2+濃度繼續(xù)增大，幼苗體內(nèi)的MDA含量逐漸下降，可能是因為隨著細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)一步被破壞，植物逐步喪失對脅迫因子的抵御能力，產(chǎn)生的MDA逐漸減少。

逆境脅迫下，植物產(chǎn)生的游離氨基酸對于其維持胞內(nèi)水勢、解除物質(zhì)毒害和貯存氮素有著重要的意義[31]。趙慧杰研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫會增加甜菜幼苗體內(nèi)游離氨基酸的釋放量[32]。氨基酸一方面可以作為細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，另一方面可以保護(hù)酶和膜的結(jié)構(gòu)，并參與植物代謝。本研究證明，隨著鐵脅迫程度的提升，幼苗體內(nèi)的游離氨基酸含量不斷上升。這可能是由于高鐵脅迫引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解，從而造成游離氨基酸含量上升。與MDA相似，游離氨基酸的含量在較高濃度處理組呈下降趨勢，其原因可能也是由于鐵中毒作用，甜菜幼苗細(xì)胞活性大幅下降，造成游離氨基酸含量顯著下降。

4 結(jié) 論

高濃度的Fe2+會顯著降低甜菜的幼苗生物量和株高；隨著Fe2+濃度的提高，甜菜幼苗的光合色素含量和葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度均不斷下降；另外，甜菜幼苗對高鐵脅迫的響應(yīng)還包括細(xì)胞脂膜(細(xì)胞膜和葉綠體膜系統(tǒng))的損傷，增加體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度以緩解脂膜損傷對其造成的傷害。