魏 多， 李佳佳， 高 卓,2， 劉銘曦，馬龍彪， 興 旺， 劉大麗

(1．黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院 省高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱150080；2．黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 哈爾濱 150080； 3．哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 哈爾濱 150025)

0 引 言

作為世界第二大糖料作物，甜菜是除了甘蔗之外糖的主要來源之一，世界上約35%的糖是由甜菜供應(yīng)而來的[1]。甜菜屬于耐寒作物，在中國的種植區(qū)域主要位于東北三省、新疆和內(nèi)蒙古等地。由于耕地的過度使用以及作物的不規(guī)范化生產(chǎn)，導(dǎo)致甜菜在種植過程中常常遭受氮脅迫等環(huán)境逆境的限制。植物在生長的過程中無時(shí)無刻不需要氮元素，并通過將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的方式來吸收氮素[2]。合理施用氮肥可以有效提高作物產(chǎn)量，但施用過度會導(dǎo)致病蟲害增加和環(huán)境污染等問題[3-5]?；诖?，使用銨基肥料和硝化抑制劑可減輕氮肥對環(huán)境的影響[6]，根系對養(yǎng)分的吸收和運(yùn)輸能力與不同植物器官的需求相匹配，這也進(jìn)一步?jīng)Q定了植物能否健康茁壯地生長。如果營養(yǎng)素可利用性下降或非生物性脅迫抑制了根系的正常功能，則會導(dǎo)致植物營養(yǎng)不足，降低它們的生態(tài)競爭力和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力[7]。

本文在對甜菜AMTs基因的前期研究中，通過對受氮逆境脅迫的甜菜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，在參與甜菜氮逆境脅迫相關(guān)的眾多基因中，BvAMT3-3基因的表達(dá)極其顯著。因此，利用RT-PCR的方法克隆了甜菜BvAMT3-3基因，并通過qPCR分析氮脅迫下目的基因的表達(dá)特性，結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和生物軟件對BvAMT3-3的基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)特點(diǎn)進(jìn)行了分析和預(yù)測，為進(jìn)一步了解甜菜AMTs基因以及甜菜中銨鹽的吸收機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對提高甜菜氮素的利用效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試甜菜為國家甜菜種質(zhì)資源中期庫提供的780016B/12優(yōu)。種子通過蛭石培養(yǎng)萌發(fā)后，將兩片子葉期的甜菜幼苗培養(yǎng)于N濃度為10 mmol·L-1的Hoagland營養(yǎng)液中，培養(yǎng)兩周后，取甜菜幼葉組織用于RNA的提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成

利用Invitrogen公司的Trizol reagent提取甜菜新鮮材料的總RNA[17]，并根據(jù)北京TransGen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2BvAMT3-3基因的克隆

以甜菜總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶(TOYOBO)PCR擴(kuò)增該基因CDS全長。根據(jù)甜菜BvAMT3-3基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物如下：

BvAMT3-3-F (5′-3′): CGGAA TTCATG GGA GAC ATA TTG CCA CCC

BvAMT3-3-R (5′-3′): GCTCT AGATTA TAC AAC TTG AGT TGC ACC AA

PCR產(chǎn)物電泳檢測后，將回收產(chǎn)物與載體pEASY Blunt連接，轉(zhuǎn)入T1感受態(tài)細(xì)胞。加入含LB的培養(yǎng)基后倒平板并搖置涂勻，37 ℃搖菌過夜后，篩選出陽性克隆的菌落進(jìn)行PCR檢測，選擇電泳檢測結(jié)果正確的菌液送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索甜菜BvAMT3基因家族成員；同時(shí)BvAMT3-3的開放閱讀框和CDS通過NCBI的ORF finder分析得到；利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫預(yù)測該基因所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。通過PSORT對甜菜AMT3-3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；通過TMHHM分析跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目。利用Prot-Param和ProtScale分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，SignalP 5.0 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測分析。利用MEGA7軟件將甜菜AMT2家族的基因序列與其他植物的AMT2成員進(jìn)行聚類分析和Neighbor-Joining進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 植物培養(yǎng)及逆境處理

甜菜種子于蛭石中培養(yǎng)一周，待種子萌發(fā)后，選取生長良好的甜菜幼苗移栽入N濃度為0、1.5和10 mmol·L-1的Hoagland營養(yǎng)液中，N0為缺氮，N1.5為低氮，以10 mmol·L-1生長的甜菜幼苗為對照。取處理0、24和48 h時(shí)間點(diǎn)植株的相同部位葉片作為樣品，然后將甜菜幼苗移至正常培養(yǎng)條件，取恢復(fù)生長24和48 h的植株樣品，經(jīng)研磨后用于測量相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.2.5BvAMT3-3基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)甜菜BvAMT3-3基因(XM_010669058)堿基序列信息設(shè)計(jì)特異引物，以Trizol法提取的甜菜葉片RNA為模板，以BvGAPDH(NC_024800)基因?yàn)閮?nèi)參，利用SuperReal PreMix Plus (TianGen)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)采用SYBR Green為標(biāo)記物。每個(gè)樣品3次重復(fù)，利用2-△△CT方法對目的基因表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

表1 相關(guān)qRT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvAMT3-3基因的克隆

以甜菜總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用帶有EcoRI和Xbal酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了一條大約1 420 bp的BvAMT3-3擴(kuò)增片段，如圖1所示。

將BvAMT3-3基因經(jīng)載體連接，Kana陽性克隆篩選后，對所得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，雙酶切電泳檢測。得到了大小為3 928 bp的載體pEASY-Blunt條帶和大小為1 427 bp的目的基因片BvAMT3-3的條帶，如圖2所示。

M: Trans 2K Plus II Marker(TransGen)

2.2 甜菜BvAMT3-3基因的序列分析

甜菜BvAMT3-3基因的CDS全長為1 427 bp，編碼475個(gè)氨基酸，如圖3所示。根據(jù)ProtParam分析計(jì)算，這個(gè)基因所編碼蛋白的分子量(Molecular weight)為51.055 kDa，等電點(diǎn)(Theoretical pI)為8.98。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index)為29.61，屬于穩(wěn)定蛋白。根據(jù)SignalP 5.0分析，該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。對甜菜AMT蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明BvAMT3-3蛋白以α-螺旋為主，占43.79%，其次為無規(guī)則卷曲，占34.53%，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例較小，如表2所示。亞細(xì)胞定位預(yù)測BvAMT3-3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)上。

圖3 甜菜BvAMT3-3基因序列信息

表2 BvAMT3-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位

2.3 BvAMT3-3蛋白的親水性和疏水性預(yù)測

用 ProtScale 軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性/親水性分析，正值越大表示越疏水，負(fù)值越大表示越親水，介于+0.5～-0.5之間的主要為兩性氨基酸。結(jié)果表明，BvAMT3-3蛋白的疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，如圖4所示，預(yù)測該蛋白為疏水蛋白，這與ProtParam分析結(jié)果一致。

圖4 BvAMT3-3蛋白親疏水性預(yù)測

2.4 BvAMT3-3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

運(yùn)用TMHMM Server 2.0對BvAMT3-3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明,BvAMT3-3含有11個(gè)跨膜螺旋區(qū)，屬于跨膜蛋白，這與AMTs基因家族含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)果相一致，如圖5所示。

2.5 甜菜BvAMT3-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CD-Search預(yù)測該基因所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示,甜菜BvAMT3-3蛋白存在一個(gè)銨轉(zhuǎn)運(yùn)保守結(jié)構(gòu)域，位置在25～443 aa,這保證了AMT在轉(zhuǎn)運(yùn)銨鹽中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。

圖5 BvAMT3-3蛋白的跨膜螺旋區(qū)分析

2.6 甜菜BvAMT3-3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 BvAMT3-3蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.6 Prediction for tertiary structure of BvAMT3-3 protein

將甜菜BvAMT3-3的氨基酸序列提交到SWISSMODEL在線軟件，采用同源建模法預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，該蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α-螺旋構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.7 甜菜BvAMT3-3基因的結(jié)構(gòu)及進(jìn)化樹分析

外顯子-內(nèi)含子的數(shù)量和結(jié)構(gòu)可以在一定程度上反映一些基因家族在進(jìn)化過程中的變化情況[18]。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索到5個(gè)甜菜AMT基因家族成員，利用GSDS 2.0對5個(gè)AMT基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BvAMT3-3基因含有2個(gè)內(nèi)含子，BvAMT1-1和BvAMT1-4均含有1個(gè)內(nèi)含子，而BvAMT1-2和BvAMT1-3均沒有內(nèi)含子，如圖7所示。對來自甜菜、菠菜、水稻、谷子等6個(gè)物種中的12個(gè)AMT3基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，甜菜BvAMT3-3基因與菠菜SoAMT3-1基因位于同一進(jìn)化分支，如圖8所示。

圖7 甜菜AMT基因結(jié)構(gòu)特征

圖8 甜菜與其他物種之間的AMT3家族進(jìn)化樹

2.8 甜菜BvAMT3-3基因在低氮脅迫下的表達(dá)特性分析

AMT基因是參與植物氮逆境脅迫應(yīng)答的主要基因之一，它調(diào)控了植物體內(nèi)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成。在對甜菜進(jìn)行氮脅迫處理前，各組甜菜中BvAMT3-3的表達(dá)量幾乎基本處于相同水平，甜菜葉片部位的相對表達(dá)量在1.54左右，根部的表達(dá)量在1.27左右。當(dāng)缺氮(N0)和低氮(N1.5)處理24 h后，BvAMT3-3在葉片和根部的表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，并且隨著處理時(shí)間的增加，表達(dá)量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，且缺氮條件比低氮更容易誘導(dǎo)BvAMT3-3的表達(dá)。其中，葉片和根部的BvAMT3-3表達(dá)量均在48 h時(shí)達(dá)到最大，分別為0 h的4.62和3.32倍，可以看出N0處理更能誘導(dǎo)BvAMT3-3的表達(dá)。同時(shí)，該基因在葉片的表達(dá)比根部更為活躍，如圖9所示?；謴?fù)處理24和48 h后，BvAMT3-3表達(dá)量較脅迫處理時(shí)有所下降，但仍維持在較高水平。這說明即便恢復(fù)正常生長條件，氮逆境造成的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)還依舊存在，并且很有可能通過BvAMT3-3介導(dǎo)合成銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，來調(diào)控氮代謝平衡。

3 討 論

4 結(jié) 論

本文利用RT-PCR克隆了基因BvAMT3-3，與生物信息學(xué)分析的結(jié)果相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白可能會作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與到甜菜對氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)中。當(dāng)受到氮逆境脅迫時(shí)，BvAMT3-3基因表達(dá)量隨處理時(shí)間的增長呈現(xiàn)上升趨勢，表達(dá)的水平遠(yuǎn)大于未受到氮脅迫處理時(shí)的水平，表明該基因參與了甜菜對銨態(tài)氮吸收循環(huán)再利用的過程。甜菜受到氮逆境脅迫時(shí)，BvAMT3-3基因可能會參與到逆境脅迫的應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中，可能通過直接或間接的作用降低外界銨態(tài)氮含量的變化對細(xì)胞的損害，從而提高甜菜抵抗氮逆境脅迫的能力。研究結(jié)果有助于下一步研究不同氮水平條件下的基因表達(dá)特征、染色體定位和啟動子順式作用元件，同時(shí)也為加深植物吸收氮素的生理和分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。