唐藝旻， 李英杰， 高立娣， 秦世麗， 趙 冰， 靳鳳龍

(1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市場監(jiān)督管理局食品藥品檢驗(yàn)檢測中心, 齊齊哈爾 161005)

0 引 言

手性廣泛存在于自然界中，手性藥物對映體三維空間結(jié)構(gòu)之間的差異可導(dǎo)致不同的藥理學(xué)和毒理學(xué)差異[1-2]。手性藥物約占全球藥物銷售量的1/3，這些手性藥物對映體中的一種對映體可能產(chǎn)生預(yù)期的藥理學(xué)反應(yīng)，而相反的一種可能只表現(xiàn)出拮抗或毒性反應(yīng)[3]。正是對映體藥理活性的重要差異，使得手性藥物對映體的拆分逐漸受到重視。

高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)[4-6]、氣相色譜(Gas chromatography, GC)[7-8]、毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis, CE)[9]和毛細(xì)管電色譜(Capillary electrochromatography, CEC)[10]等經(jīng)常用于對映體分離。但HPLC與GC所使用的手性柱價(jià)格昂貴，且大多數(shù)情況下，一個(gè)特定的手性柱只能分析某一類物質(zhì)，應(yīng)用往往受限。CEC不僅具有CE的高效性，而且兼具HPLC的高選擇性，成為一種選擇性好、分離效率高、消耗試劑量小的分離分析技術(shù)[10]。β-環(huán)糊精(β-CD)及其衍生物由于空腔大小適中、良好的柔韌性和天然的手性已被廣泛使用在CEC和CE領(lǐng)域中[11]。Zhou等開發(fā)了一種溶膠-凝膠“一步法”來制備SBE-β-CD-二氧化硅雜化整體柱，整體柱內(nèi)固定相具有均一的結(jié)構(gòu)。優(yōu)化色譜條件后，在CEC中共分離了26種外消旋分析物，其中17種達(dá)到了基線對映體分離[12]。Deng等首次通過一鍋法制備了羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)功能化的毛細(xì)管整體柱，通過NMR和拉曼光譜確認(rèn)了HP-β-CD在整體柱上成功鍵合，在CEC上成功分離外消旋化合物，包括外消旋抗膽堿能藥物、甲哌嗪醇及其中間體等[13]。

本文旨在合成一種具有多個(gè)作用位點(diǎn)、制備簡單的β-CD衍生物，6-EA-β-CD在β-CD基礎(chǔ)上引入雙鍵和胺基等基團(tuán)，不僅克服了β-CD水溶性差的缺點(diǎn)，而且增強(qiáng)了氫鍵和包結(jié)等作用。利用CEC的高效性和高選擇性，對手性化合物進(jìn)行拆分，為手性拆分領(lǐng)域提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7100 CE毛細(xì)管電泳儀(美國安捷倫公司)、6230 TOF MS-質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；S-4300 SEM(日本日立公司)；Nicolet 380 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀(美國熱電公司)；DMBA 200 光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司)；石英毛細(xì)管柱(75 μm i.d.， 365 μm o.d.， 中國銳豐色譜器材公司)。

β-環(huán)糊精、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、1,3-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(分析純，阿拉丁試劑)；鹽酸班布特羅(中國天津中央藥業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單6-丙烯酰乙二胺-β-環(huán)糊精(6-EA-β-CD)的合成

首先合成磺?；?β-環(huán)糊精(6-OTs-β-CD)[14]和單6-乙二胺-β-環(huán)糊精(6-en-β-CD)[15],然后稱取2 g 6-en-β-CD和0.36 g DCC，溶解于20 mL DMF中，控制反應(yīng)溫度15 ℃下滴加0.34 g丙烯酸，30 min后，室溫下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后真空抽濾,濾液用一定量的丙酮析出沉淀，真空干燥，得淺黃色固體產(chǎn)物 6-EA-β-CD。

1.2.2 整體柱的制備

1.3 電色譜柱性能研究

以D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅為分析物，對6-EA-β-CD整體柱的手性拆分性能進(jìn)行了研究。在毛細(xì)管電色譜運(yùn)行過程中，以20 mmol·L-1醋酸銨作為緩沖液，50 mbar×3 s壓力進(jìn)樣，紫外檢測波長為200 nm。

同時(shí)采用單一變量法以分離度為考察指標(biāo)，優(yōu)化考察影響分離的主要因素，包括緩沖溶液的pH值、電壓和柱溫，如表1所示，從而得出最佳電色譜分離條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 6-EA-β-CD的表征

2.1.1 紅外光譜分析

表1 CEC分離條件的影響因素

圖1 紅外光譜圖: (a)磺酰化-β-環(huán)糊精; (b)乙二

圖2 6-EA-β-CD 的質(zhì)譜圖

2.1.2 質(zhì)譜分析

采用ESI-TOF/MS對合成產(chǎn)物進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。6-EA-β-CD分子量為1 230，圖2中m/z為1 231.453 63的離子峰對應(yīng)6-EA-β-CD的[M+H]+峰，m/z為1 253.483 71的離子峰對應(yīng)[M+Na]+峰，m/z為1 269.398 5是6-EA-β-CD的 [M+K]+峰，從而可以斷定合成的環(huán)糊精衍生物為6-EA-β-CD。

2.2 整體柱制備條件的優(yōu)化

采用一步鍵合法制備的整體柱制備簡單、環(huán)保，具有較好的重現(xiàn)性以及較大的固定相承載能力[16]。當(dāng)6-EA-β-CD單體溶液的濃度為0.15 g·mL-1、EDMA功能單體的量為0.060 g時(shí)，保證總體系中致孔劑質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 86%。分別采用光學(xué)顯微鏡和甲醇經(jīng)高壓恒流泵流入整體柱中的流速為指標(biāo)評價(jià)整體柱的鍵合情況和通透性，結(jié)果如表2所示。

表2 反應(yīng)溫度及時(shí)間對柱性能的影響

從表2光學(xué)顯微鏡觀察到的結(jié)果可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間不變時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高,柱內(nèi)固定相的鍵合情況從稀疏變得緊密。結(jié)合甲醇流速可以看出，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，甲醇流速適中，柱內(nèi)通透性較好，從而確定最佳反應(yīng)溫度為45 ℃。反應(yīng)時(shí)間也是整體柱內(nèi)固定相鍵合情況的重要影響因素，一方面反應(yīng)時(shí)間過少，固定相鍵合不緊密，溶質(zhì)的保留較??；另一方面，若反應(yīng)時(shí)間太長，柱內(nèi)的團(tuán)聚現(xiàn)象明顯，柱子通透性下降。當(dāng)反應(yīng)溫度均為45 ℃、反應(yīng)時(shí)間為6和8 h時(shí)，柱內(nèi)固定相鍵合量較多且相對均勻，結(jié)合甲醇流速可以看出，反應(yīng)時(shí)間為8 h時(shí)，甲醇流速較慢，柱子通透性差，而反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)甲醇流速適中，通透性良好，最終確定反應(yīng)時(shí)間6 h為最佳條件。與呂仁江等制備的丙烯酰胺-β-CD毛細(xì)管電色譜整體柱[17]相比，兩種整體柱均采用一步鍵合法制備，本文通過改變反應(yīng)溫度和時(shí)間，在更短的時(shí)間內(nèi)制得了具有良好性能的整體柱。

2.3 整體柱的掃描電鏡表征

整體柱內(nèi)部固定相形貌采用SEM進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。圖3(a)和圖3(b)分別為在最佳制柱條件(6-EA-β-CD單體溶液的濃度為0.15 g·mL-1、EDMA為0.060 g、總體系中致孔劑質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 86%、反應(yīng)溫度為45 ℃、反應(yīng)6 h)下制得的整體柱橫截面和局部截面掃描電鏡圖?？梢钥闯?，柱內(nèi)形成了孔徑較均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中，大中孔徑保證了一定的通透性。固定相與柱內(nèi)壁鍵合緊密，柱內(nèi)固定相不會輕易被流動(dòng)相沖出柱外，整體柱穩(wěn)定性得以提高。當(dāng)其他制柱條件不變，控制反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)制得的整體柱橫截面如圖3(c)所示，柱內(nèi)固定相鍵合量較少，柱內(nèi)稀疏，通透性好；反應(yīng)時(shí)間為8 h時(shí)制得的整體柱橫截面如圖3(d)所示，柱內(nèi)鍵合緊密，有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，柱內(nèi)孔徑較小，通透性差。由此驗(yàn)證，在最佳制柱條件下制得的整體柱具有較好的形貌，柱性能良好，可用于進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

2.4 整體柱的性能研究

柱效是色譜柱分離能力的度量，通過計(jì)算有效塔板數(shù)對該整體柱的柱效進(jìn)行評價(jià)。整體柱長度一定時(shí)，有效塔板數(shù)越大，表明物質(zhì)在整體柱中分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利。本文在最佳制柱條件下制備三根電色譜整體柱，以硫脲為中性標(biāo)記物，對所制備整體柱的柱效進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果如表3所示。三根柱子平均柱效達(dá)到64 251 plates·m-1以上，并且單根柱子柱效的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.728%、0.151%和0.895%。表明該整體柱柱效較高，有一定的分離能力，且柱子相對穩(wěn)定。

表3 整體柱柱效評價(jià)

以D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅為分析物,對6-EA-β-CD整體柱的手性拆分性能進(jìn)行進(jìn)一步考察。手性化合物拆分過程會受緩沖溶液pH、電壓及溫度的影響，故采用控制單一變量法對這些條件進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖4所示。圖4(a)～圖4(c)分別為緩沖溶液pH值、電壓和溫度對分析物分離度的影響，從圖4中可以看出，當(dāng)pH值為8.5、電壓為20 kV、分離溫度為20 ℃時(shí)，D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅的分離度均達(dá)到最大值，故確定兩種分析物的最佳CEC運(yùn)行條件為pH=8.5、20 mmol·L-1醋酸銨緩沖溶液、電壓為20 kV、溫度為20 ℃、50 mbar×3 s壓力進(jìn)樣、紫外檢測波長為200 nm。在最佳CEC分離條件下，D，L-丙氨酸和鹽酸班布特羅均達(dá)到基線分離，分離圖如圖5和圖6所示。利用本文自制的6-EA-β-CD電色譜整體柱，在最佳CEC運(yùn)行條件下，鹽酸班布特羅對映體在7 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，與劉樹仁等制備的整體柱對鹽酸班布特羅對映體拆分結(jié)果[18]相比，兩整體柱均能實(shí)現(xiàn)對鹽酸班布特羅對映體的拆分，但本文的6-EA-β-CD電色譜整體柱能在更短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對鹽酸班布特羅對映體的基線分離，更加高效快速。

圖4 CEC運(yùn)行條件對分離度的影響

圖5 丙氨酸電色譜分離圖

3 結(jié) 論

采用簡單的制備方法成功制備了一種新型毛細(xì)管電色譜整體柱，即6-EA-β-CD毛細(xì)管電色譜整體柱。在優(yōu)化的CEC運(yùn)行模式下，D,L-丙氨酸及鹽酸班布特羅均在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。該整體柱具有試劑消耗少和分離能力強(qiáng)的特點(diǎn)，為今后研究提供一定的基礎(chǔ)。