王婧彥 管一春 于曉娜 張 文

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院(鄭州，453002)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是不孕女性常見(jiàn)內(nèi)分泌疾病，目前采用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕效果并不理想[1]。水通道蛋白(AQP)屬一組跨膜蛋白，能夠運(yùn)輸水、甘油、尿素等中性小分子，具有通透性，可參與尿濃縮、外分泌腺功能、腦脊液分泌等過(guò)程，在PCOS中AQP8、AQP9表達(dá)異常與功能改變可能影響卵泡生長(zhǎng)形成過(guò)程，從而影響妊娠結(jié)局[2]。AQP8、AQP9異常表達(dá)是否影響PCOS患者IVF-ET助孕結(jié)局。因此，本研究以PCOS IVF-ET助孕患者為研究對(duì)象，檢測(cè)其血清AQP8、AQP9水平，探究其與妊娠結(jié)局關(guān)系，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2017年12月—2019年10月本院就診的PCOS不孕患者行IVF-ET 治療156例臨床資料，收集患者一般資料，包括年齡、體質(zhì)指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)激素值促卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)，雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)、泌乳素(PRL)、促性腺激素(Gn)用量、使用時(shí)間。根據(jù)助孕結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①符合PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次行IVF-ET 助孕治療；③年齡20～35歲；④資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他原因?qū)е赂咝奂に兀虎趦?nèi)分泌疾?。虎圩訉m及卵巢器質(zhì)性病變。本研究經(jīng)患者知情并同意，經(jīng)本院倫理協(xié)會(huì)審核并通過(guò)。

1.2IVF-ET

采用早卵泡期降調(diào)節(jié)方案促排卵，月經(jīng)周期第2～4天肌注長(zhǎng)效GnRH-a(曲普瑞林，aufore Ipsen Pharma)3.75mg ，降調(diào)30d后行陰道超聲監(jiān)測(cè)并空腹測(cè)血LH、FSH、E2、P及HCG，達(dá)降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)行Gn啟動(dòng)。注射重組人促卵泡激素Gn(果納芬，默克雪蘭諾有限公司)，起始劑量100～300 IU/d，根據(jù)LH、E2、P和超聲檢測(cè)卵泡大小調(diào)整Gn用量。當(dāng)至少3個(gè)卵泡≥17mm或2個(gè)卵泡≥18mm時(shí)，當(dāng)晚給重組人絨促性素注射液(予艾澤，默克雪蘭諾有限公司)250μg注射，36h～38h陰道B超引導(dǎo)下取卵培養(yǎng)，受精后16～18 h評(píng)估受精情況，24 h評(píng)估受精卵卵裂情況，胚胎培養(yǎng)至第2天行胚胎評(píng)級(jí)，胚胎養(yǎng)至第5天將1枚囊胚移植到宮腔內(nèi)。取卵后每日黃體酮陰道緩釋凝膠8%(雪諾酮，英國(guó)FleetlaboratoriesLimited)90mg/1支；口服地屈孕酮片(達(dá)芙通，Abbott Biologicals B.V)10mg,2次/d，第14天檢測(cè)靜脈血β-人絨毛膜促性腺激素，陰性者停止陰塞繼而口服用藥，陽(yáng)性者繼續(xù)使用至移植后8周停藥；移植后4周行陰道B超確認(rèn)是否臨床妊娠，同時(shí)記錄獲卵數(shù)、成熟卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率。

1.3 血清AQP8、AQP9

月經(jīng)第3天收集患者外周靜脈血，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定血清AQP8、AQP9水平。RNA提取試劑盒提取總RNA，Thermo Scientific RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(賽默飛世爾，貨號(hào)分別為：12183018A、K1622)。AQP8 F：5’-ATGAATCCCGCCCGTGCT-3’、R：5’-CCCATCTCCAATGAAGCACCTAAT-3’，AQP9 F：5’-GTCTTGAAGAGCAGCAGCTTAGCGAA-3’、R：5’-AATCCAACATTGATAGTGATGACCC-3’，β-actin F：5’-CCAGGGCGTTATGGTAGGCA-3’、R：5’-TTCCATATCGTCCCAGTTGGT-3’(引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成)。上樣體系：2× SYBR Green qPCR Master Mix(南通飛宇生物科技有限公司)10 μl，cDNA(40 ng/μl)1 μl，上/下游引物(10 μM)0.5/0.5 μl，ddH2O 8 μl。反應(yīng)條件：94℃、60 s；95℃、40 s，60℃、75 s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算AQP8、AQP9相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料情況

妊娠組70例，未妊娠組86例。妊娠組年齡、體質(zhì)指數(shù)、不孕年限、FSH、LH、E2、P、PRL、Gn用量、Gn使用天數(shù)與未妊娠組均無(wú)差異(P>0.05)，T水平低于未妊娠組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

組別例數(shù)P(ng/ml)T(nmol/L)PRL(μg/L)Gn用量(U)Gn使用天數(shù)未妊娠組861.03±0.351.12±0.1317.46±3.483582.58±246.8511.4±2.2妊娠組 701.04±0.261.05±0.0916.38±4.413748.08±648.8511.5±2.4t0.1993.8201.7100.8440.288P0.8430.0000.0890.4010.774

2.2 血清AQP8、AQP9水平

妊娠組血清AQP8(0.69±0.08)低于未妊娠組(0.98±0.12)，AQP9(1.35±0.11)高于未妊娠組(1.01±0.15)(t=17.322、15.813，均P=0.000)。

2.3IVF-ET結(jié)局

妊娠組成熟卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于未妊娠組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組IVF-ET 結(jié)局指標(biāo)比較

2.4 妊娠者血清AQP8、AQP9水平與T、成熟卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率關(guān)系

Spearman法分析結(jié)果顯示，PCOS患者 IVF-ET助孕妊娠成功者血清中AQP8與T呈正相關(guān)、與成熟卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)、AQP9與T呈負(fù)相關(guān)、與受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 血清因子水平與各指標(biāo)關(guān)系

2.5 影響PCOS患者IVF-ET助孕結(jié)局的多因素分析

將PCOS患者IVF-ET助孕結(jié)局是否發(fā)生妊娠為因變量，以AQP8、AQP9、T、成熟卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示，AQP8、T是影響PCOS患者IVF-ET助孕妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，AQP9、優(yōu)質(zhì)胚胎率是保護(hù)因素(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 影響IVF-ET助孕結(jié)局的多因素分析

3 討論

PCOS是育齡期婦女常見(jiàn)且復(fù)雜的生殖內(nèi)分泌疾病，在育齡婦女中發(fā)病率達(dá)8%～18%[4]。IVF-ET為PCOS患者帶來(lái)了福祉，垂體降調(diào)節(jié)可提高卵子質(zhì)量、提高成功率；但垂體降調(diào)節(jié)后過(guò)低LH會(huì)使卵泡發(fā)育受限，引發(fā)黃體功能不足，可能降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎著床失敗，影響妊娠結(jié)局[5-6]。提高IVF-ET術(shù)后成功率是目前輔助生殖技術(shù)重要研究方向。

AQP目前發(fā)現(xiàn)13種，AQP0-AQP12。是細(xì)胞膜上高選擇性“孔道”，可調(diào)控水合離子及部分大分子細(xì)胞進(jìn)出，其水平變化引起功能異常，導(dǎo)致機(jī)體滲透壓失衡，造成代謝紊亂和生長(zhǎng)性能受限，影響機(jī)體健康[7]；在哺乳動(dòng)物子宮、胎膜、卵泡、胎盤等組織中均有表達(dá)。在孕早期人絨毛膜組織中AQP(1、3、4、5、8、9、11)均有表達(dá)[8]，在囊胚期只表達(dá)AQP8、AQP9[9]，在卵巢竇狀卵泡中AQP9表達(dá)[10]。AQP8對(duì)水有高度選擇性，在母胎液體平衡調(diào)節(jié)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用；AQP8在生殖系統(tǒng)中水平降低能夠降低顆粒細(xì)胞的水滲透性，而促使顆粒細(xì)胞介導(dǎo)卵泡內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加排卵、成熟卵泡數(shù)量和受精能力，增強(qiáng)雌性繁殖能力[11]；AQP8異常上調(diào)破壞滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)水、電解質(zhì)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓及酸堿度變化，細(xì)胞生長(zhǎng)隨之改變，影響妊娠[12]。AQP9在未成熟卵母細(xì)胞中表達(dá)，參與卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程；在顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在卵泡發(fā)育中可維持卵泡細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)[13]。PCOS中AQP9水平明顯降低，高雄激素血癥中AQP9低表達(dá)[14]。AQP8參與卵母細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，AQP9與妊娠成功率關(guān)系密切[15]。本研究，與未妊娠組相比，妊娠組血清中AQP8水平降低、AQP9水平升高，提示PCOS患者行 IVF-ET未妊娠者AQP8異常升高，可能導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)功能紊亂，影響電解質(zhì)平衡、酸堿度等而影響妊娠；AQP9水平降低影響卵泡發(fā)育過(guò)程，可能與高雄激素有關(guān)而影響妊娠。本研究結(jié)果，與未妊娠組相比，妊娠組成熟卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率升高，T水平降低。T與AQP8呈正相關(guān)、與AQP9呈負(fù)相關(guān)，成熟卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率與AQP8呈負(fù)相關(guān)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率與AQP9呈正相關(guān)；AQP8、T是PCOS患者IVF-ET助孕妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而AQP9、優(yōu)質(zhì)胚胎率是保護(hù)因素。提示PCOS患者IVF-ET助孕時(shí)AQP8低表達(dá)、AQP9高表達(dá)可增加妊娠成功的幾率，可能是二者通過(guò)降低T水平促進(jìn)卵泡發(fā)育等，最終體現(xiàn)在優(yōu)質(zhì)胚胎率上，促進(jìn)妊娠過(guò)程。

綜上所述，PCOS患者 IVF-ET助孕妊娠成功者血清中AQP8水平降低、AQP9水平升高，與IVF-ET結(jié)局指標(biāo)關(guān)系密切，可能影響卵泡生長(zhǎng)，提示臨床有一定意義。但PCOS受多因素影響，AQP8、AQP9可能只是一個(gè)方面影響，需尋找更多影響PCOS因素。