于 帥 宋風(fēng)麗 劉紅巧 高萬(wàn)里

北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 (102600)

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)目前已發(fā)現(xiàn)100多種類(lèi)型，其中40余種與生殖道疾病關(guān)系密切。有研究表明，90%以上宮頸鱗癌中可檢測(cè)出HPV高危型別，持續(xù)感染HPV為導(dǎo)致宮頸癌的重要因素[2]。注射宮頸癌疫苗預(yù)防宮頸癌作用顯著，明確地區(qū)間HPV基因型分布及混合感染的基因型對(duì)治療及預(yù)防宮頸癌意義重大[3]。本研究檢測(cè)大興地區(qū)女性體檢13200例宮頸上皮細(xì)胞中HPV基因分型，分析轄區(qū)內(nèi)女性宮頸HPV感染狀況及亞型分布情況，為預(yù)防提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2017年5月—2019年12月在本院體檢的來(lái)自大興地區(qū)女性作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)錐切手術(shù)史、宮頸環(huán)切史；②初次行HPV檢測(cè)，無(wú)HPV感染史；③知情本研究?jī)?nèi)容并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他宮頸疾病者；②對(duì)本研究依從性差；③合并其他感染性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 試劑與儀器

高危型HPV分型核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司，全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(SLAN-96P，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)，全自動(dòng)核酸檢測(cè)處理系統(tǒng)Autrax193購(gòu)自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司，生物安全柜(HFsafe1200Class)購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3HPV檢測(cè)

常規(guī)采集標(biāo)本[4]。提取DNA模板：取適量組織在液氮中研磨，并在其中加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，再加入RNass及蛋白酶K進(jìn)行消化，再一次用苯酚、氯仿、異丙醇等抽提，清洗沉淀用乙醇，在以TE回溶。引物設(shè)計(jì)：擴(kuò)增反應(yīng)選擇HPV晚期編碼蛋白的LI區(qū)中通用引物GP5+/6+，引物序列GP6+為5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATT-C-3’，GP5+為5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’，引物采用HPV通用引物委托上海生工合成。在GP5+/6+通用引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)HPV16/18特異性探針，其中HPV18為HEX-5’-CTTCTACACAGTCTCCTGTA-3’-BHQ，HPV16為FAM-5’-TCATTATGTGCTGCCATAT-3’-BHQ，探針為自主設(shè)計(jì)委托上海生工合成并修飾。HPV16/18陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建：在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)片段重疊延伸法分別構(gòu)建HPV16/18陽(yáng)性質(zhì)粒，依據(jù)NCBI公布的DNA序列，各人工合成兩條80bp長(zhǎng)的片段，重疊、中間互補(bǔ)15個(gè)堿基。先將兩個(gè)有重疊序列的片段在PCR體系中重疊延伸15個(gè)循環(huán)，模板為延伸產(chǎn)物，在Taq酶作用下，第二輪PCR以上下游引物(GP5+/6+)擴(kuò)增HPV DNA。在1%瓊脂糖凝膠PCR產(chǎn)物電泳，檢測(cè)片段大小，確定目的片段后回收產(chǎn)物，將其與pMD-19T載體連接后在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，得到HPV16/18陽(yáng)性質(zhì)控。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl中含有GP5+引物0.4μmol/L、GP6+引物中0.4μmol/L、0.6μmol/L Taqman探針，2.5U Taq酶，dNTP 0.5μmol/L，及10×buffer(Mg2+)2.5μl及5μl 陽(yáng)性質(zhì)粒或者DNA模板，以蒸餾水為空白對(duì)照。擴(kuò)增條件：95℃下3min預(yù)變性，95℃下20s變性，在45℃下45s退火，72℃ 30s延伸，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，于退火階段采集熒光信號(hào)，結(jié)束后10min延伸。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同年齡段女性HPV陽(yáng)性分布

共納入檢測(cè)13200例，年齡18～78歲，HPV感染2251例，感染率為17.1%。各年齡組均以單一感染為主，陽(yáng)性感染以21～30歲為主，HPV感染率以<21歲者最高。各年齡組間感染率有差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各年齡段HPV感染情況[例(%)]

2.2HPV感染者各亞型分布

2251例HPV陽(yáng)性者共檢測(cè)各亞型3215項(xiàng)次，其中低危亞型檢測(cè)454項(xiàng)次(14.1%)，以HPV6、11、CP8304為主；高危型2716項(xiàng)次(85.9%)，以HPV16、58、52、53為主。見(jiàn)表2。

表2 HPV感染者各亞型分布

2.3HPV感染類(lèi)型

2251例感染HPV者以高危型、單一感染為主，HPV多重感染者中以高危型、雙重感染為主。見(jiàn)表3。

表3 感染HPV類(lèi)型分布[例(%)]

3 討論

宮頸癌為臨床常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，病死率居全球第二，以HPV持續(xù)感染為癌前病變及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件[5]。截止目前，臨床可檢測(cè)100多種HPV基因型，且宮頸病變的級(jí)別與HPV感染基因型有一定關(guān)系，臨床根據(jù)病毒致癌性主要分為兩類(lèi)[6]：高危型HPV，與高度宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切；低危型HPV，常引發(fā)低度宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變及生殖器濕疣等良性病變[7]。高危型HPV持續(xù)感染進(jìn)而使細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)控發(fā)生異常，導(dǎo)致細(xì)胞不停增殖并逐漸惡化，最終引發(fā)浸潤(rùn)性宮頸癌[8-9]。早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)對(duì)防控宮頸癌，降低其發(fā)病率、死亡率意義重大。

不同地區(qū)和國(guó)家HPV感染亞型及感染率分布差異較大，了解本地區(qū)HPV感染現(xiàn)狀及HPV基因型分布可為本地區(qū)人群進(jìn)行針對(duì)性預(yù)防接種，對(duì)高發(fā)人群行干預(yù)及監(jiān)測(cè)降低感染HPV病毒及患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)，是目前預(yù)防宮頸癌發(fā)生發(fā)展較有效措施[10]。本研究對(duì)體檢的13200例女性HPV基因檢測(cè)結(jié)果顯示，HPV感染陽(yáng)性率為17.1%。與張建海等報(bào)道陽(yáng)性率20.64%相近[11]。但與郝慧靜報(bào)道的北京昌平區(qū)HPV感染陽(yáng)性率(10.21%)[12]差別較大，可能與所處地理位置不同，及人口流動(dòng)性影響有關(guān)。本研究HPV陽(yáng)性者中以HPV16(22.3%)、HPV58(18.5%)、HPV52(17.4%)、HPV53(14.1%)4種類(lèi)型最為常見(jiàn)，在各年齡段女性中均居首位，與相關(guān)研究結(jié)果一致[13-14]；其次為HPV58、HPV52兩種類(lèi)型，與亞洲人群特征相符。而低危型HPV感染占所感染者20.2%，以HPV11為主。在所有各亞型陽(yáng)性HPV總體項(xiàng)次中，高危型占總項(xiàng)次85.9%，低危型占14.1%，說(shuō)明本地區(qū)HPV感染的主要亞型為高危型HPV，應(yīng)在治療中引起足夠重視。

感染HPV亞型分布地域性較強(qiáng)，本研究HPV亞型與其他地區(qū)不全部一致。王睿報(bào)道山東地區(qū)高危HPV亞型前5位分別為HPV16、52、58、56、53[15]，楊翠翠等報(bào)道臨沂市高危HPV亞型前5位分別為HPV16、52、58、51、53[16]。各個(gè)地區(qū)HPV16均占主要地位，但其他亞型地域性明顯，故明確地區(qū)主要流行的HPV亞型對(duì)預(yù)防和治療女性HPV相關(guān)生殖道疾病意義重大。本研究結(jié)果顯示，高危型單一感染為本地區(qū)女性感染HPV的主要類(lèi)型，占全部感染的76.3%；多重感染占所有感染者18.1%，以高危型雙重感染為主。提示本地區(qū)應(yīng)對(duì)高危型單一感染患者加強(qiáng)治療及隨訪，對(duì)多重感染者尤其是雙重感染者應(yīng)以監(jiān)控為主。

有研究顯示[17]，年齡也是影響宮頸癌發(fā)生及HPV感染的重要因素。本研究顯示，陽(yáng)性感染者主要以21～30歲、31～40歲為主，HPV感染率以<21歲者最高。推測(cè)與20～40歲人群生理特征有關(guān)，為性活躍人群。由于HPV感染發(fā)生多呈現(xiàn)出一過(guò)性，一般于8～10個(gè)月內(nèi)可清除，但宮頸癌發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而上升。因此應(yīng)對(duì)20～40歲人群HPV感染給予高度重視并積極干預(yù)，減少發(fā)展為宮頸癌。

綜上所述，本院調(diào)查的本地區(qū)女性HPV陽(yáng)性率為17.1%，以高危型單一感染為主，其中感染亞型以HPV16、HPV58、HPV52、HPV53為主。