陳玫君 田艷紅 郭飛波

湖北省天門市第一人民醫(yī)院(431700)

在新生兒出生缺陷中染色體異常是最常見病因，產(chǎn)前檢查常采用超聲影像學(xué)篩查及血清學(xué)檢測評估胎兒出生缺陷風(fēng)險，但存在檢測精度和準(zhǔn)確性不高等缺點[1]。介入性羊水染色體核型分析產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性達98%～99%，成為胎兒染色體異常及出生缺陷診斷金標(biāo)準(zhǔn)[2]。但羊水穿刺可增加宮內(nèi)感染、羊水滲漏、流產(chǎn)等風(fēng)險，且不適用于所有孕婦。1997年LO[3]開創(chuàng)了利用孕婦外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)。目前NIPT已廣泛用于產(chǎn)前21-三體、18-三體、13-三體、性染色體等染色體異常檢測，檢測敏感性與特異性顯著提升。然而大量臨床實踐[4]，NIPT假陽性時有發(fā)生，與羊水穿刺核型檢測相比假陽性發(fā)生率為0.1%～0.3%，限制了NIPT廣泛應(yīng)用。目前針對NIPT檢測染色體異常的研究較多，但鮮有關(guān)于探究NIPT假陽性的相關(guān)報道。鑒于此，本研究分析了NIPT診斷染色體異常的應(yīng)用價值，重點分析NIPT假陽性緣由，為提高NIPT臨床應(yīng)用提供參考與借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月—2019年12月于本院行NIPT的單活胎孕婦10236例臨床資料，年齡(28.7±8.5)歲(19～47)歲，孕周(19.6±5.4)周(11～23)周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)B超檢查確定孕周11～23周；②單胎妊娠；③知情同意且自愿行NIPT檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：①染色體異常；②接受過移植手術(shù)、干細(xì)胞治療或短期輸注異體血液制品、免疫治療等。NIPT檢測陽性孕婦，根據(jù)本人及家屬意愿行羊膜腔穿刺胎兒染色體核型分析。對NIPT假陽性且孕婦自愿繼續(xù)妊娠分娩者行NIPT假陽性原因分析。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 檢測方法及評估

采集孕婦空腹外周靜脈血漿， 4℃恒溫離心處理后取上層血漿，采用德國Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取胎兒游離DNA。采用文庫構(gòu)建試劑盒(中國博奧公司)構(gòu)建測序文庫，采用高通量基因測序技術(shù)進行樣本測序檢測。計算每條染色體reads所占比例及Z值，評估染色體非整倍體異常情況。對NIPT檢測提示高風(fēng)險者，向孕婦及家屬進行遺傳咨詢與羊膜腔穿刺胎兒染色體核型分析建議，并告知侵入性產(chǎn)前診斷風(fēng)險，簽署知情同意書。B超引導(dǎo)下經(jīng)孕婦腹羊膜腔穿刺取羊水20ml，常規(guī)處理后，采用ISCN2016計數(shù)與核型分析，提示NIPT假陽性且孕婦自愿繼續(xù)妊娠并分娩者，于孕婦分娩后采集孕婦靜脈血，按NIPT檢測方法對樣本進行處理與高通量DNA測序檢測。采集胎盤組織樣本，生理鹽水清洗母血經(jīng)處理后采用高通量DNA測序檢測胎盤組織中染色體情況。NIPT檢測結(jié)果提示染色體非整倍體疾病高風(fēng)險，而經(jīng)羊水穿刺胎兒染色體核型分析正常，則認(rèn)為NIPT假陽性。

2 結(jié)果

2.1NIPT檢測

10236例孕婦，IPT檢測染色體異常111例，檢出率1.1%。其中21-三體異常34例(30.6%)，18-三體異常20例(18.0%)，13-三體異常17例(15.3%)，性染色體異常35例(31.5%)，其他染色體異常5例(4.5%)。

2.2 不同方法檢測及妊娠結(jié)局對比

NIPT檢測提示異常者行羊膜腔穿刺檢測復(fù)核，其中確診92例(92/111，82.9%)，未見異常19例(19/111，17.1%)，總假陽性率為0.2%(19/10236)。見表1。

表1 不同方法檢測及妊娠結(jié)局對比

2.3 假陽性原因驗證分析

19例NIPT假陽性孕婦繼續(xù)妊娠并分娩，經(jīng)與胎盤組織、母血樣本對比發(fā)現(xiàn)，12例胎盤組織檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果一致；5例母血檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果一致； 2例無法確定NIPT假陽性原因。見表2。

表2 19例不同標(biāo)本NIPT檢測異常原因分析(例)

3 討論

染色體非整倍體疾病是新生兒出生缺陷的主要原因，可通過產(chǎn)前診斷采取必要終止妊娠[5]。常規(guī)B超檢查和血清學(xué)檢測無法作為染色體異常的篩查手段，孕婦外周血中游離DNA為產(chǎn)前無創(chuàng)診斷提供了新的思路。相關(guān)研究證實[6]，孕婦在孕10周時外周血即可檢測到150bps胎兒DNA片段，此片段基本包含胎兒所有基因組序列，通過檢測孕婦外周血游離DNA即可獲得胎兒染色體情況。因此孕婦外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)逐漸成為新生兒出生缺陷產(chǎn)前檢測的新寵。

我國衛(wèi)生部于2012年組織NIPT技術(shù)論證，但隨著假陽性案例報道增多，衛(wèi)生部于2014年停止了NIPT檢測。隨后通過設(shè)立多家試驗點充分臨床評估后，于2016年發(fā)布有序開展NIPT檢測通知，并對21-三體、18-三體、13-三體、性染色體等檢出率做出規(guī)定[7]。近年臨床實踐及研究發(fā)現(xiàn)，NIPT對染色體異常檢出率不盡相同。紀(jì)巍[8]等報道NIPT對21-三體異常預(yù)測值為100.00%，對18-三體異常預(yù)測值為66.67% ，對13-三體異常預(yù)測值為50.00%；左娟等[9]報道NIPT對21-三體、18-三體、13-三體、性染色體檢出率分別為88.9%、88.9%、50%、83.9%。本研究染色體異常檢出率(1.1%)與文獻報道[10-11]NIPT陽性檢出率較一致。相比傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法，NIPT對21-三體、18-三體、13-三體、性染色體靈敏度均較高，尤以對21-三體靈敏度最高。本研究通過與羊水穿刺胎兒染色體核型分析結(jié)果對比，顯示NIPT總體假陽性率(0.2%)與羅麗等雙[12]報道結(jié)果一致。提示NIPT并非對所有染色體異常陽性預(yù)測值均持續(xù)敏感，考慮NIPT對倒位、易位等染色體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)不敏感，因此會產(chǎn)生假陽性或假陰性，從而影響到檢測診斷結(jié)果。因此，NIPT雖然是一種較好的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷手段，但并不能徹底取代產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)核型分析方法。

相關(guān)研究證實胎兒與胎盤的組織遺傳物質(zhì)相同[13]。而孕婦外周血游離DNA絕大部分來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，故正常情況下通過檢測孕婦外周血胎兒游離DNA可獲得與胎兒組織相同的檢測結(jié)果。然而，胎盤細(xì)胞系增殖過程可能出現(xiàn)有絲分裂錯誤，形成部分異常染色體組織結(jié)構(gòu)，并與正常染色體胎盤組織結(jié)構(gòu)嵌合在一起，形成限制性胎盤嵌合體，胎兒染色體核型依舊正常。這種情況下若胎盤異常染色體細(xì)胞釋放游離DNA，經(jīng)NIPT檢測即可發(fā)現(xiàn)異常，而胎兒染色體正常，即為假陽性。本研究中19例假陽性中12例胎盤組織檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，提示限制性胎盤嵌合體導(dǎo)致胎盤來源染色體異常是NIPT假陽性的主要因素之一。孕婦外周血游離DNA大部分來源于母體，雖然經(jīng)過嚴(yán)格分離與純化處理，但樣本中仍會存在部分DNA片段影響胎兒游離DNA檢測，同樣會表現(xiàn)NIPT假陽性。此外，女性擁有兩條X染色體，外周血中可能存在小片段染色體缺失或重復(fù)，從而檢測孕婦外周血游離DNA時常見染色體異常[14]。本研究19例NIPT假陽性中5例母血檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，且其中4例為性染色體異常假陽性，說明母血異常DNA可能是導(dǎo)致NIPT假陽性的另一原因。臨床公認(rèn)NIPT適用孕周為12～26周，由于NIPT檢測所需胎兒游離DNA并非來源于胎兒本身而是胎盤，游離DNA含量<4%時NIPT假陽性率高。因此必須要求孕周>12周才能保證充足游離DNA以滿足檢測要求[15]。而<26周則是為產(chǎn)前診斷預(yù)留充分時間以備相應(yīng)干預(yù)。本研究中2例孕11周接受NIPT檢測均為假陽性，可能與NIPT檢測時孕周不足12周導(dǎo)致外周血胎兒游離DNA量不足所致。需要說明的是，由于本研究中NIPT假陽性病例樣本量少，發(fā)生機理及確切原因仍需深入研究。

總之，NIPT在產(chǎn)前胎兒染色體異常診斷中具有較高檢出率，但不排除假陽性可能須引起足夠重視。研究結(jié)果初步揭示胎盤中異常游離DNA進入母血、母血已有異常游離DNA以及孕周不足是導(dǎo)致NIPT假陽性的主要原因，提示臨床實驗室必須嚴(yán)格NIPT檢測規(guī)范，確保NIPT檢測有效性。針對NIPT假陽性問題必須聯(lián)合其他檢測手段排除胎兒染色體異常可能。