胡雅瓊，白 俊，陳 琳，陳新璐，張麗萍，周丹丹，王 玉，尹崇高，李洪利，劉雨清

1.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院外科護理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；4.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊261053

在過去的幾十年里，肺癌已經(jīng)成為全球常見的癌癥之一［1］。而非小細胞肺癌發(fā)生率約占肺癌的85%，其中肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的亞型［2］。癌癥防治的進展使得近年來肺癌的死亡率大幅下降，但肺腺癌仍然是影響癌癥死亡率的重要因素［3-4］。因此，研究探討肺腺癌增殖和侵襲的分子機制，尋找靶向治療肺腺癌的指標，對肺腺癌的治療具有重要意義。

miRNA是一種約22 nt的非編碼RNA。在癌癥中，基因組的不穩(wěn)定性、表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄因子的改變影響miRNA，從而在影響細胞發(fā)育、分化、增殖、生存和死亡的許多基因中起調(diào)控作用［5-6］。miRNA的失調(diào)與多種人類癌癥有關(guān)，作為典型的癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［7］。前期相關(guān)研究［7-10］證明，miR-625-5p可以影響多種類型的癌癥細胞的增殖和侵襲。但是，miR-625-5p在肺腺癌發(fā)展進程中產(chǎn)生的作用尚不清楚。

PRKACA基因位于人類第19號染色體p13.1，長約26000個核苷酸，是環(huán)磷酸腺苷依賴性蛋白激酶A催化亞基的編碼基因［11］。蛋白激酶A在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使cAMP的關(guān)鍵效應(yīng)中起到核心作用，是為了應(yīng)對由多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)引起的G蛋白偶聯(lián)受體激活而產(chǎn)生的［12］。已有研究［13-14］證明，PRKACA在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，但是PRKACA與miR-625-5p之間的關(guān)系及其影響肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制仍不清楚，需要我們進行深入的研究與探索。

本研究旨在探索miR-625-5p對肺腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響及分子機制，為后續(xù)肺腺癌的診斷和治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人正常肺上皮細胞BEAS-2B，肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1299購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、新生牛血清購自美國HyClone公司，F(xiàn)12-K培養(yǎng)基購自美國Sigma公司。β-actin（ab8226）、PRKACA（ab32376）抗體購自英國Abcam公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，miR-625-5p敲低及對照質(zhì)粒、蛋白激酶cAMP激活催化亞基α（protein kinase cAMPactivated catalytic subunit alpha，PRKACA）基因敲低及對照質(zhì)粒、熒光素酶報告基因載體均購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 網(wǎng)上在線數(shù)據(jù)庫

采用GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找肺腺癌組織與正常肺組織差異表達的miRNA，GSE74190數(shù)據(jù)集是包含36例肺腺癌組織和44例相鄰正常組織的miRNA表達譜，運用GEO2R進行分析，以log2FC＞1、P＜0.05為篩選閾值，選出差異表達的上調(diào)miRNA。采用Starbase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析miR-625-5p在肺腺癌組織中的表達情況，查找與miR-625-5p相關(guān)的靶蛋白并分析hub基因在肺腺癌中的表達情況。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

所有細胞均按照ATCC提供的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，饑餓細胞30 min，將對照質(zhì)粒NC及敲低miR-625-5p質(zhì)粒用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞。將細胞分組：①si-NC/A549組，轉(zhuǎn)染敲低miR-625-5p質(zhì)粒的對照質(zhì)粒的A549細胞；② si-miR-625-5p/A549組，轉(zhuǎn)染敲低miR-625-5p質(zhì)粒的A549細胞；③si-control/A549組，轉(zhuǎn)染敲低PRKACA質(zhì)粒的對照質(zhì)粒的A549細胞；④ si-PRKACA/A549組，轉(zhuǎn)染敲低PRKACA質(zhì)粒的A549細胞；⑤ si-PRKACA+si-NC/A549組，共轉(zhuǎn)染敲低PRKACA質(zhì)粒和敲低miR-625-5p質(zhì)粒的對照質(zhì)粒的A549細胞；⑥ si-PRKACA+si-miR-625-5p/A549組，共轉(zhuǎn)染敲低PRKACA質(zhì)粒和敲低miR-625-5p質(zhì)粒的A549細胞。相關(guān)質(zhì)粒由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建獲得，miR-625-5p敲低質(zhì)粒序列si-miR-625-5p：5'-GGACTATAGAACTTTCCCCCT-3'；miR-625-5p敲低對照質(zhì)粒序列si-NC：5'-AGGUCTAAGUUCUAUGCACC-3'；PRKACA敲低質(zhì)粒序列si-PRKACA：5'-GATAATCAGAGGGACAGAAAC-3'；PRKACA敲低對照質(zhì)粒序列si-control：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

將各組生長良好的細胞培育24 h，TRIzol提取細胞總RNA，并合成cDNA，以cDNA為模板，采用U6作為內(nèi)參，檢測細胞中miR-625-5p表達量。RTFQ-PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。miR-625-5p上游引物為5'-CGCGAGGGGGAAAGTTCTA-3'，下游引物為5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，莖環(huán)結(jié)構(gòu)為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACGGACTA-3’。運用2-△△Ct計算結(jié)果。

1.5 EdU細胞增殖實驗

整個實驗按照BeyoClickTMEdU-594細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作，于顯微鏡下隨機選取5個視野拍照計數(shù)，計算結(jié)果。

1.6 Transwell侵襲實驗

取轉(zhuǎn)染后的細胞懸液200 μL，4×104個細胞，分別添加到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的小室上室中，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液 500 μL，培養(yǎng)24 h。24 h后用甲醇固定20 min，PBS清洗3次，Giemsa染液染色35 min，PBS清洗3次，吸棄PBS晾干后于顯微鏡下隨機選取5個視野拍照計數(shù)，取平均值為最終結(jié)果。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

將轉(zhuǎn)染后的各組細胞裂解，收集懸液，提取總蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)濃度并進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃過夜、1×TBST洗膜、二抗常溫溫育1 h、顯影、曝光，分析灰度值，計算結(jié)果。抗體配制如下：PRKACA抗體（1∶500），采用β-actin（1∶1000）作為內(nèi)參。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

將A549細胞接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，饑餓30 min后，將miR-625-5p過表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒和PRKACA的野生型質(zhì)粒PRKACA-3'-UTR-Wt、突變型質(zhì)粒PRKACA-3'-UTR-Mut共轉(zhuǎn)染入A549細胞，培養(yǎng)48 h后，PLB裂解液裂解15 min提取懸液，測定熒光素酶活性，分析相對熒光強度，計算結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

每個實驗重復(fù)3次，用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量結(jié)果使用x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-625-5p在肺腺癌組織及細胞中表達上調(diào)

通過分析GSE74190數(shù)據(jù)集，篩選其中符合log2FC＞1、P＜0.05條件的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-625-5p的log2FC=1.93（P＜0.0001），在肺腺癌組織與正常肺組織中的表達差異明顯（圖1A），因此我們選擇miR-625-5p為研究對象。運用Starbase數(shù)據(jù)庫分析miR-625-5p的表達情況，發(fā)現(xiàn)在20例正常肺組織和512例肺腺癌組織中，miR-625-5p在肺腺癌組織中表達明顯上調(diào)（圖1B）。RTFQPCR顯示，miR-625-5p在肺腺癌細胞A549、H1299中的表達（3.20±0.12、2.18±0.01）相比在BEAS-2B細胞中顯著升高（圖1C，P＜0.0001），結(jié)果表明，miR-625-5p在肺腺癌的發(fā)展中可能起著癌基因的作用。由于在A549細胞的表達差異更為明顯，故采用A549細胞進行后續(xù)研究。

圖1 miR-625-5p在肺腺癌組織及細胞中的表達情況Fig.1 The expression of miR-625-5p in lung adenocarcinoma tissues and cells

2.2 miR-625-5p促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲

RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后的A549細胞中miR-625-5p表達（0.30±0.05）明顯下調(diào)（圖2A，P＜0.0001），提示轉(zhuǎn)染成功。EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示，si-miR-625-5p/A549組的EdU細胞增殖比為0.30±0.03，與si-NC/A549組（0.60±0.05）相比顯著降低，證明下調(diào)miR-625-5p對A549細胞具有增殖抑制作用（圖2B，P=0.0023）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與si-NC/A549組的細胞數(shù)（348.00±7.26）相比，si-miR-625-5p/A549組穿膜的細胞數(shù)（237.67±10.62）明顯減少（圖2C，P=0.0003），證明敲低miR-625-5p后，A549細胞侵襲能力降低。以上結(jié)果表明，miR-625-5p能夠促進A549細胞的增殖和侵襲能力。

圖2 miR-625-5p促進肺腺癌細胞增殖和侵襲Fig.2 miR-625-5p promoted the proliferation and invasion of lung adenocarcinoma cells

2.3 miR-625-5p靶向結(jié)合PRKACA

運用Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與miR-625-5p結(jié)合相關(guān)的靶基因，使用Cytoscape 3.6.1軟件對相關(guān)靶基因進行分析，根據(jù)cytoHubba計算各節(jié)點degree得分篩選hub基因并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）。Western blot檢測結(jié)果顯示，肺腺癌細胞A549中PRKACA的表達（0.47±0.04）明顯低于正常肺上皮細胞BEAS-2B（1.00±0.05，圖3B，P=0.0004），證明PRKACA在肺腺癌細胞中表達下調(diào)。因此，我們考慮PRKACA可能為miR-625-5p靶向結(jié)合的關(guān)鍵基因。Western blot檢測結(jié)果顯示，si-miR-625-5p/A549組中PRKACA的表達（2.40±0.09）明顯高于si-NC/A549組（1.00±0.06，圖3C，P＜0.0001），證實miR-625-5p與PRKACA在A549細胞中表達呈負相關(guān)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，PRKACA-3'-UTR-Wt/miR-625-5p組A549細胞的相對熒光素酶活性（0.48±0.06）明顯低于PRKACA-3'-UTR-Wt/miR-NC組（1.00±0.05，圖3D，P=0.0008），而PRKACA-3'-UTR-Mut/miR-625-5p組和PRKACA-3'-UTR-Mut/miR-NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.9279）。該結(jié)果表明，PRKACA-3'-UTR區(qū)是miR-625-5p的結(jié)合位點。以上結(jié)果表明，miR-625-5p通過靶向結(jié)合PRKACA負向調(diào)控肺腺癌細胞。

圖3 miR-625-5p靶向結(jié)合PRKACAFig.3 miR-625-5p targeted PRKACA

2.4 miR-625-5p靶向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞的增殖

Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-control/A549組相比，si-PRKACA/A549組PRKACA的表達明顯下調(diào)（P=0.0053），而與si-PRKACA+si-NC/A549組相比，si-PRKACA+si-miR-625-5p/A549組PRKACA的表達顯著上調(diào)（P=0.0015），結(jié)果證實，敲低miR-625-5p能抑制PRKACA干擾質(zhì)粒對A549細胞PRKACA表達的抑制作用（圖4A）。EdU細胞增殖實驗檢測發(fā)現(xiàn)，si-PRKACA/A549組EdU細胞增殖（0.52±0.04）比si-control/A549組（0.37±0.02）明顯增多（P=0.0097），而 si-PRKACA+si-miR-625-5p/A549組EdU細胞增殖（0.36±0.02）比si-PRKACA+si-NC/A549組（0.46±0.03）明顯減少（圖4B，P=0.0119）。結(jié)果表明，PRKACA下調(diào)能夠促進A549細胞增殖，而miR-625-5p下調(diào)能夠逆轉(zhuǎn)敲低PRKACA對肺腺癌細胞A549增殖能力的促進作用。由此可見，miR-625-5p負向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞增殖。

圖4 miR-625-5p靶向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞的增殖Fig.4 miR-625-5p promoted the proliferation of lung adenocarcinoma cells by targeting PRKACA

2.5 miR-625-5p靶向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞的侵襲

通過transwell侵襲實驗檢測miR-625-5p通過靶向結(jié)合PRKACA對肺腺癌的侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與si-control/A549組（265.33±16.21）相比，si-PRKACA/A549組穿膜的細胞數(shù)（345.00±17.28）明顯增多（P=0.0047），而與si-PRKACA+si-NC/A549組（339.67±10.78）相比，si-PRKACA+si-miR-625-5p/A549組穿膜的細胞數(shù)（233.67±0.04）明顯減少（圖5，P=0.0015），證實下調(diào)PRKACA對A549細胞具有侵襲促進作用，而miR-625-5p下調(diào)則可以逆轉(zhuǎn)敲低PRKACA對A549細胞侵襲能力的影響。由此可見，miR-625-5p通過負向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞侵襲。

圖5 miR-625-5p靶向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌細胞侵襲、遷移Fig.5 miR-625-5p promoted the invasion and migration of lung adenocarcinoma cells by targeting PRKACA vs si-control (×20)

3 討論

大量研究表明，miRNA控制多種生物學(xué)功能，如細胞增殖、分化和凋亡［15-17］。miRNA是可以在外周血中發(fā)現(xiàn)和測量的穩(wěn)定分子，顯示出作為檢測、分類、預(yù)后的生物標志物的潛力［18］。miR-625-5p已被證實與癌癥密切相關(guān)，能夠抑制宮頸癌和膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲［19-20］。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫確定miR-625-5p為研究對象。上述實驗表明，miR-625-5p在肺腺癌細胞中表達升高并促進肺腺癌的增殖與侵襲能力，證實miR-625-5p能促進肺腺癌細胞A549增殖和侵襲，是參與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子。

PRKACA是蛋白激酶催化亞單位的一種主要的亞型，在大多數(shù)組織中表達［11］。許多研究［14，21-22］表明，PRKACA可在某種程度上影響癌癥的發(fā)展。由此我們可以推斷PRKACA可用作癌癥的生物標志物及預(yù)后預(yù)測工具［23］。近年來已經(jīng)進行了大量涉及miRNA治療劑的臨床前研究，但到目前為止，只有少數(shù)miRNA治療劑進入了臨床開發(fā)。開發(fā)基于miRNA的治療藥物的最大挑戰(zhàn)之一是為每種疾病類型確定最佳的miRNA靶標。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測與miR-625-5p結(jié)合的相關(guān)靶基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，PRKACA與miR-625-5p靶向結(jié)合，并通過實驗證明miR-625-5p可通過靶向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌的增殖和侵襲，提示PRKACA基因為miR-625-5p靶向結(jié)合的關(guān)鍵基因。前期相關(guān)研究表明，miR-625可以通過靶向HOXB5激活Wnt/β-catenin途徑來抑制非小細胞肺癌的進展［24］。本研究中，我們了解到miR-625-5p影響肺腺癌增殖和侵襲的分子機制，但是miR-625-5p靶向PRKACA究竟通過哪種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程尚未可知。為了更加深入地了解miR-625-5p對肺腺癌發(fā)展進程的影響，對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究將成為我們后續(xù)研究的重點。

綜上所述，miR-625-5p在肺腺癌中表達上調(diào)，通過負向調(diào)控PRKACA促進肺腺癌的增殖和侵襲。