潘金微，趙玲艷，馬丁，王增光，鄧放明

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙，410128)

魏斯氏菌(Weissella)是乳酸菌的一種，在醬油、泡菜、豆豉和香腸等發(fā)酵食品中廣泛存在[1]，不僅能夠提高發(fā)酵食品產(chǎn)品質(zhì)量或者縮短發(fā)酵周期還可以賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味[2]，并且具有合成細(xì)菌素[3]、產(chǎn)胞外多糖[4]、降膽固醇[5]、降甘油三酯[6]和抑制炎癥水平[7]等益生特性。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)通過對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，統(tǒng)計(jì)測(cè)得細(xì)胞在某一特定時(shí)間特定條件下每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量[8]，有助于精準(zhǔn)評(píng)估細(xì)胞表型和對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行改良[9]，有低成本、高通量、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)[10]。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較菌體在不同環(huán)境、不同刺激物作用下基因表達(dá)量的差異，并對(duì)其進(jìn)行注釋和富集分析，可以研究環(huán)境及刺激物對(duì)菌體的影響及作用機(jī)理[11]。近年來，隨著RNA-Seq技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法的不斷成熟，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序因其檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬、數(shù)據(jù)重復(fù)性好而被廣泛應(yīng)用于乳酸菌研究領(lǐng)域，逐漸成為基因表達(dá)差異研究、功能注釋和代謝機(jī)制分析的重要手段，為深入理解微生物蘊(yùn)含的分子機(jī)制提供了可信的證據(jù)[11-15]。陳興麟等[16]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)新瓊四糖和新瓊六糖在促進(jìn)乳酸菌生長的作用機(jī)理上具有極大的相似性。田源等[17]利用宏轉(zhuǎn)錄組揭示了在濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中與正丙醇合成有關(guān)的微生物與代謝途徑。目前對(duì)魏斯氏菌轉(zhuǎn)錄組方面的研究仍然比較匱乏。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析比對(duì)了魏斯氏菌10d-17在饑餓及正常狀態(tài)下RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，篩選差異基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)注釋和代謝路徑KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋，從而闡明在關(guān)鍵代謝路徑中基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，探究關(guān)鍵基因和蛋白參與代謝模式的調(diào)控及其調(diào)控方式。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

魏斯氏菌(Weissella)由本課題組從前期實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵剁辣椒中分離得到。

1.2 試劑盒及儀器

Qubitarna分析試劑盒，美國加利福尼亞州生命技術(shù)公司；RNA提取試劑盒，Clontech(USA)；RNA Nano6000檢測(cè)試劑盒、安捷倫生物分析儀2100，安捷倫技術(shù)公司(美國)；RNA保護(hù)劑，ZYMO RESEARCH(USA)；Qubit?RNA分析試劑盒，IMPLEN(USA)；Qubi 2.0熒光計(jì)，Invitrogen(USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將保藏的菌種從-80 ℃冰箱取出，于4 ℃解凍30 min，吸取適量菌液于MRS液體培養(yǎng)基中于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，然后劃線分離，挑取單菌落液體培養(yǎng)，如此反復(fù)操作3次，得到活化后的種子液。

1.3.2 樣品的制備

饑餓處理組：按1.3.1方法活化后，參考ERCAN等[18]研究方法，取10 mL菌液，于4 ℃ 8 000 r/min離心后去上清液，0.9%生理鹽水洗脫2次，離心后取菌泥靜置菌2 h。后加入RNA保護(hù)劑(保護(hù)劑添加比例為1∶1)，4 ℃ 8 000 r/min離心后去上清液，迅速放入液氮中冷凍(后續(xù)測(cè)序結(jié)果中以J-菌種編號(hào)標(biāo)記)。

正常培養(yǎng)組：菌種按1.3.1的方法活化后，饑餓處理2 h后，按1%接種量接入10 mL已殺菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h。后4 ℃ 8 000 r/min離心取菌泥，添加RNA保護(hù)劑，離心后去上清液，放入液氮中冷凍保藏(后續(xù)測(cè)序結(jié)果中以Z-菌種編號(hào)標(biāo)記)。每1株菌株每1種處理做3份平行。

1.3.3 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

使用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的RNA樣品是否降解或被污染，然后用Nano光度計(jì)?分光光度計(jì)檢查RNA純度，Qubit?2.0熒光計(jì)測(cè)量RNA濃度[19]。質(zhì)量檢測(cè)最后采用安捷倫生物分析儀評(píng)估RNA完整性。

1.3.4 建立測(cè)序文庫及測(cè)序

RNA的質(zhì)量檢測(cè)后，使用Ribo-zero試劑盒和fragmentation buffer去除rRNA，使被打斷成短片段的mRNA富集。以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒作用下，用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈。利用Qia Quick PCR試劑盒和緩沖液合成純化第2條cDNA鏈，并加EB緩沖液洗后進(jìn)行末端修復(fù)，添加poly A連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到最終的測(cè)序，并利用Ilumina hiseq 2000平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。然后去除原始數(shù)據(jù)中不合格的Reads，得到高質(zhì)量的Clean Reads，并利用Bowtie2軟件將高質(zhì)量的Clean Reads進(jìn)行基因比對(duì)分析。通過HT seq將比對(duì)基因組的Reads進(jìn)一步定位到基因上，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因比對(duì)的Reads數(shù)，通過FPKM值表示基因的表達(dá)量，并對(duì)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平進(jìn)行分析。在有生物學(xué)重復(fù)的條件下，以P<0.05作為閾值篩選差異基因，并對(duì)其進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

魏斯氏菌做饑餓和全營養(yǎng)2種處理，每組3個(gè)平行，共6個(gè)樣本。由表1可知，每個(gè)樣品RNA總量均≥6 g(3 g為合格)，質(zhì)量濃度≥200 g/L。同時(shí)OD260/280均>1.5，RNA完整值(RNA integrity number，RIN)≥8(≥6為合格)，且total RNA條帶清晰，說明RNA質(zhì)量符合后續(xù)測(cè)序要求。

表1 樣品RNA質(zhì)量情況Table 1 RNA quality of samples

2.2 RNA-seq測(cè)序質(zhì)量結(jié)果

由表2可知，魏斯氏菌做饑餓和全營養(yǎng)2種處理，每組3個(gè)平行，每1組高通量測(cè)序獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)量都在1.7 GB以上，單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率為0.02%，其中Q20(Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的百分比)均在98.36%以上，質(zhì)量值在Q30也都高于94.65%。去除含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列后，各組得到的高質(zhì)量reads數(shù)為983萬～1 359萬條。從RNA-seq測(cè)序質(zhì)量結(jié)果來看，本次測(cè)序的數(shù)據(jù)飽和度高，符合開展后續(xù)轉(zhuǎn)錄本拼接實(shí)驗(yàn)的要求。

表2 不同樣品RNA-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況表Table 2 Output quality of RNA-seq data of different samples

2.3 魏斯氏菌10d-17 RNA-seq相關(guān)性檢查

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果要求生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作是可重復(fù)的，并且變異不大。同時(shí)為確保后續(xù)的差異性基因分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以通過繪制皮爾遜相關(guān)系數(shù)圖，來檢驗(yàn)樣品間的基因表達(dá)水平的相關(guān)性。由圖1可知，各個(gè)樣品間生物學(xué)重復(fù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)均≥0.97,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。

2.4 魏斯氏菌轉(zhuǎn)錄結(jié)果分析

2.4.1 組間差異表達(dá)基因分析

為了使不同的基因和實(shí)驗(yàn)之間估計(jì)的基因表達(dá)水平有可比性，本實(shí)驗(yàn)除了用reads計(jì)數(shù)來估計(jì)基因的表達(dá)水平外還加入了FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)的概念，用FPKM值是否≥1作為判斷基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。這株魏斯氏菌注釋到結(jié)構(gòu)中73%以上的基因的FPKM值>1[20]。本實(shí)驗(yàn)為了揭示饑餓處理對(duì)魏斯氏菌的基因表達(dá)的影響，通過DE seq軟件對(duì)read count標(biāo)準(zhǔn)化，再根據(jù)負(fù)二項(xiàng)分布P模型計(jì)算得出假設(shè)檢驗(yàn)概率(P)，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)值，以P<0.05作為篩選的差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，若差異基因log2fold change>0，則該差異基因是上調(diào)，反之則下調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)一共篩選得到1 018個(gè)顯著性差異基因，509個(gè)顯著表達(dá)上調(diào)差異基因，509個(gè)顯著表達(dá)下調(diào)基因。因此，饑餓脅迫可引起魏斯氏菌代謝過程中基因的顯著變化。了解魏斯氏菌在饑餓脅迫下的轉(zhuǎn)錄組差異，對(duì)更好的利用乳酸菌具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

2.4.2 魏斯氏菌10d-17差異基因GO富集

使用軟件GO seq對(duì)差異基因進(jìn)行GO基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系注釋后,將基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述分為分子功能、生物過程和細(xì)胞組成3個(gè)部分。本研究挑選了富集最顯著的30個(gè)GO term，得到了饑餓處理后與正常狀態(tài)下的差異基因GO富集柱狀圖。如圖2所示，最顯著的30個(gè)GO term中，有14個(gè)term與RNA的活動(dòng)相關(guān)，并且沒有term涉及細(xì)胞組成。由此可見，魏斯氏菌的生命活動(dòng)與RNA的活動(dòng)息息相關(guān)，主要通過調(diào)整與轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控蛋白，從而提高環(huán)境適應(yīng)性，而營養(yǎng)限制對(duì)魏斯氏菌細(xì)胞組成方面的影響不大。

GO功能注釋分析結(jié)果顯示，在篩選得到的1 018 個(gè)顯著性差異基因中，有772個(gè)基因獲得GO功能注釋信息，其中上調(diào)基因有380個(gè)，下調(diào)基因有392個(gè)。有667個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的1個(gè)GO功能條目，有309個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的1個(gè)GO功能條目，以及639個(gè)基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的1個(gè)GO功能條目。生物過程二級(jí)分類中基因數(shù)目最多的類別是RNA代謝過程，該分類包括了167個(gè)差異表達(dá)基因，其中96個(gè)上調(diào)基因，61個(gè)下調(diào)基因，生物過程二級(jí)分類中基因數(shù)目最多的類別是藥物結(jié)合，包含了146個(gè)差異表達(dá)基因，其中90個(gè)上調(diào)基因，56個(gè)下調(diào)基因。富集于藥物結(jié)合的差異基因大多數(shù)與ATP結(jié)合盒式蛋白(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和氨酰-tRNA的合成有關(guān)，RNA代謝過程的差異基因與氨酰-tRNA的合成有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)是實(shí)現(xiàn)物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾緩?，能夠?qū)l(fā)酵液中的無機(jī)離子、單糖等物質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。全營養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞生命活動(dòng)活躍，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)加快。氨酰tRNA是一種與之對(duì)應(yīng)的氨基酸相結(jié)合的tRNA(也被稱作“轉(zhuǎn)移核糖核酸”)。它能夠?qū)被醾鬟f到核糖體中，并且把氨基酸加入正在延伸中的多肽鏈。氨酰-tRNA的合成收到氨酰-tRNA合成酶的調(diào)控，每1個(gè)氨酰-tRNA合成酶可識(shí)別一個(gè)特定的氨基酸與此氨基酸對(duì)應(yīng)的tRNA的特定部位。與組氨酸、頡氨酸、蘇氨酸等16種氨基酸合成相應(yīng)氨酰-tRNA的酶的調(diào)控基因均表達(dá)上調(diào)。這可能是因?yàn)樵谌珷I養(yǎng)狀態(tài)下，魏斯氏菌生長和繁殖速度加快，需要更多的蛋白質(zhì)來支持它生長，而該菌可以通過調(diào)控氨酰-tRNA合成酶的表達(dá)來加速蛋白質(zhì)的合成。

2.4.3 KEGG通路富集分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，通過KEGG通路富集和注釋能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[21]。魏斯氏菌共有290個(gè)差異基因被注釋到了43條通路，上調(diào)基因158個(gè)，下調(diào)基因132個(gè)。其中富集差異基因數(shù)量較多的通路為：生物化學(xué)代謝富集了132個(gè)差異基因，次生代謝物的生物合成富集了51個(gè)差異基因，微生物在不同環(huán)境中的代謝富集了40個(gè)差異基因，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白富集了31個(gè)差異基因。

2.4.4 魏斯氏菌10d-17糖酵解和丙酮酸代謝途徑差異基因表達(dá)分析

如表3所示，通過對(duì)2種不同狀態(tài)魏斯氏菌差異基因的分析發(fā)現(xiàn)，差異倍數(shù)大的基因集中于糖代謝和丙酮酸代謝途徑中，故選取這2個(gè)代謝途徑繪制通路圖進(jìn)行分析。如圖3所示，糖酵解通路共注釋到20個(gè)差異基因，其中5個(gè)顯著性差異基因。葡萄糖發(fā)生酵解的第1步就是葡萄糖分子在己糖激酶和鎂離子的作用下發(fā)生磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。該菌的葡萄糖-6-磷酸主要有2種去向：(1)是進(jìn)入磷酸戊糖途徑，磷酸戊糖途徑中的相關(guān)酶的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，從而促進(jìn)PRPP的生成，為嘌呤核苷酸的合成提供重要的中間產(chǎn)物；(2)是在葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸異構(gòu)酶生成果糖-6-磷酸，葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸異構(gòu)酶編碼基因有上調(diào)趨勢(shì)，可能是因?yàn)榈孜餄舛仍黾右院?，高濃度的果?6-磷酸加速了果糖-2，6-二磷酸的合成，該化合物又進(jìn)一步激活了果糖磷酸激酶的活性。果糖-1，6-二磷酸生成三磷酸甘油醛及后續(xù)代謝途徑相關(guān)編碼基因表達(dá)均下調(diào)或無明顯差異。

表3 魏斯氏菌10d-17丙酮酸代謝顯著差異基因表Table 3 Gene table of phosphotransferase system difference of Weissella 10d-17

丙酮酸代謝通路共注釋到13個(gè)差異基因，其中8個(gè)顯著性差異基因，丙酮酸核心代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，差異倍數(shù)為2～16。該菌的丙酮酸主要有3個(gè)去向：(1)在蘋果酸脫氫酶的作用下合成蘋果酸；(2)在乳酸脫氫酶的作用下合成乳酸；(3)變?yōu)橐阴］o酶A進(jìn)入丁酸代謝。但是該菌未注釋到合成蘋果酸和合成乳酸的后續(xù)相關(guān)基因，蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的相關(guān)基因表達(dá)量差異不顯著。丙酮酸脫氫酶的編碼基因變化最為顯著，在饑餓條件下，分別上調(diào)了15.1、11.9、7.5倍，說明丙酮酸脫氫酶可能是該魏斯氏菌能量代謝中的關(guān)鍵酶，且在饑餓狀態(tài)具有對(duì)抗脅迫意義。丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，E1)編碼基因分別下調(diào)了15.1、11.9、7.5倍?？赡苓€原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和乙酰-輔酶A這2種產(chǎn)物的累積使二氫硫鋅酰轉(zhuǎn)乙?；?dihydrolipoyl transacetylase，E2)停留在與乙?；Y(jié)合的形式，不能接受在E1酶上與焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)結(jié)合的乙酰基，從而抑制了丙酮酸脫羧作用。

3 結(jié)論與討論

本研究為揭示饑餓脅迫對(duì)魏斯氏菌代謝的影響，對(duì)魏斯氏菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析。結(jié)果顯示,每一組高通量測(cè)序獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)量都在1.7 GB以上，其中Q20均在98.36%以上，高質(zhì)量reads數(shù)在983萬～1 359萬條。鑒別出個(gè)顯著性1 018差異表達(dá)基因，其中實(shí)驗(yàn)組中有509個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，509個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有772個(gè)基因獲得GO功能注釋信息，主要富集于RNA代謝過程和藥物結(jié)合。這些差異表達(dá)基因在KEGG生物通路中，以生物化學(xué)代謝、次生代謝物的生物合成等代謝途徑富集顯著。并且差異倍數(shù)較大的基因都富集于糖酵解和丙酮酸代謝通路。丙酮酸代謝途徑共注釋到8個(gè)顯著差異基因。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化生成乙酰輔酶A，進(jìn)入丁酸代謝，它的核心代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下調(diào)。

在面臨饑餓脅迫時(shí)，細(xì)胞繁殖生長速度減慢，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)氨酰-tRNA合成酶表達(dá)下調(diào)。為了維持基本的能量供給，該菌提高了糖酵解和丙酮酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)。魏斯氏菌作為乳酸菌的一種，在產(chǎn)胞外多糖、抗炎癥、促進(jìn)乳桿菌生長等益生作用方面顯示出一定的優(yōu)勢(shì)，具有極高的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。并且近年來高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于乳酸菌研究領(lǐng)域，并且成為研究乳酸菌的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。但是目前對(duì)魏斯氏菌轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究還比較少。這株魏斯氏菌來源于傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒，了解魏斯氏菌在面臨饑餓脅迫時(shí)的響應(yīng)機(jī)制，為研究乳酸菌脅迫應(yīng)答機(jī)制及其工業(yè)化應(yīng)用提供新思路。