嚴(yán)豪，王志遠(yuǎn)，龐子萱，林蘋鑫，吳疆，李業(yè)*，白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

聚酮類化合物(polyketides)是細(xì)菌、真菌及植物產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，由聚酮合酶(polyketide synthase，PKSs)以?；?輔酶A(coenzyme A，CoA)為前體進(jìn)行連續(xù)縮合，經(jīng)環(huán)化、修飾最后釋放的一類天然產(chǎn)物。其中真菌是該類次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要來源[2]。許多聚酮類化合物因其具有重要而豐富的生物活性而在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，如抗菌的紅霉素、抗癌藥物阿霉素、殺蟲劑多殺菌素、抗寄生蟲藥物阿維菌素以及免疫抑制劑雷帕霉素等[3]。10,11-dehydrocurvularin屬于二羥基苯乙酸內(nèi)酯[4](dihydroxyphenylacetic acid lactones，DAL)類化合物，其因具有熱休克活性擁有優(yōu)異的廣譜抗腫瘤活性[5]。目前的研究方向大多為改造聚酮合酶以獲得結(jié)構(gòu)多樣性的活性分子[6-7]，已發(fā)現(xiàn)的一些聚酮類活性化合物普遍存在生產(chǎn)成本高、天然宿主產(chǎn)量低的問題。

近年來，微生物代謝工程的發(fā)展使得一些生產(chǎn)成本昂貴的藥物低成本化、高效率化[8]。釀酒酵母作為最簡單且安全的真核模式菌株[9]，人們對(duì)其的分子生物學(xué)改造手段及應(yīng)用十分豐富。釀酒酵母在食品和發(fā)酵過程中用于生產(chǎn)酒精飲料和面包的歷史悠久[10]，已被廣泛用于代謝途徑改造、外源合成真核生物代謝產(chǎn)物，是食品、醫(yī)藥和生物能源方面的重要生產(chǎn)用微生物[11]。釀酒酵母BJ5464-NpgA(MATαura3-52his3-Δ200leu2-Δ1trp1pep4∶HIS3prb1Δ1.6Rcan1GAL)是一種生產(chǎn)聚酮類化合物的合適宿主[12]。Pep4和Prb1的功能缺陷能有效降低外源蛋白的降解；引入了一個(gè)來源于其他真菌中的泛?；D(zhuǎn)移酶NpgA，該酶能夠活化真菌聚酮類化合物合成酶(PKSs)里的?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)結(jié)構(gòu)域。

質(zhì)粒是游離在基因組之外的環(huán)狀DNA分子，質(zhì)粒的拷貝數(shù)越高，意味著跟隨質(zhì)粒的外源基因復(fù)制越多，相對(duì)而言外源基因表達(dá)得到的蛋白就會(huì)越多。同時(shí)，通過可控質(zhì)?？截悢?shù)，調(diào)整多酶體系的不同酶的通量，優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的代謝途徑。對(duì)于質(zhì)?？截悢?shù)的研究，目前，LIAN等[13]以釀酒酵母INVSc1為出發(fā)菌株，篩選出了具有拷貝梯度的幾種篩選標(biāo)記，使用該體系組合優(yōu)化正丁醇代謝途徑，產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了100倍。也有研究構(gòu)建了拷貝數(shù)依賴的方式在酵母中表達(dá)赤點(diǎn)石斑魚壞死病毒衣殼蛋白，與野生型菌株相比產(chǎn)量增加了150倍[14]。本研究在釀酒酵母BJ5464-NpgA異源表達(dá)來源于Aspergillusterreus的聚酮化合物合酶(S1與S2)，以得到產(chǎn)物10,11-dehydrocurvularin，并通過截短啟動(dòng)子構(gòu)建轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷的整合盒，使用抗生素篩選壓調(diào)控質(zhì)粒拷貝數(shù)，以此優(yōu)化產(chǎn)物合成途徑獲得更高產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

釀酒酵母BJ5464-NpgA、原始質(zhì)粒pXK30-FLAG 30F、pXW06-FLAG 06F，攜帶土曲霉來源的聚酮合酶基因片段的質(zhì)粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS來自亞利桑那大學(xué)；質(zhì)粒pYTK-034、pYTK-077、pYTK-079通過Addgene向加州大學(xué)伯克利分校生物工程系購買，所用的大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保藏。在本研究中使用的質(zhì)粒如表1所示，本文中所用到的引物見表2，因KanMX和HygB抗生素表達(dá)盒的啟動(dòng)子均為AgTEF Promoter，其20 bp截短及更長的截短的擴(kuò)增引物均完全在啟動(dòng)子上，兩者的5′到3′端引物可通用；且兩者所用終止子均為AgTEF Terminator，其截短標(biāo)記的3′到5′端引物可通用。引物合成以及質(zhì)粒測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表1 本研究使用的質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers in this study

1.2 酶和試劑

所有限制性內(nèi)切酶，Thermo Fisher Scientific；2×Es Taq MasterMix(Dye)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA高效連接液，TaKaRa公司；同源重組酶、HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR，諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒，Axygen公司；遺傳霉素、潮霉素、酵母DNA提取試劑[V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1]，北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素，上海生工；酵母-Trp/-Ura雙缺培養(yǎng)基，上海懋康生物科技有限公司；10,11-dehydrocurvularin標(biāo)準(zhǔn)品，Toronto Research Chemicals。

1.3 培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)條件

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)，抗生素使用氨芐青霉素，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。釀酒酵母使用YPD(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%酵母提取物+2%蛋白胨+2%葡萄糖)與合成培養(yǎng)基在250 mL 搖瓶中培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min。使用深孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，裝液量為2 mL，其他條件同上。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建

為得到攜帶mruby2熒光的表征載體pBL001-30F-mruby2，用引物mruby2-F/mruby2-R擴(kuò)增兩端帶有pXK30-FLAG 30F質(zhì)粒的同源臂的mruby2基因片段。將擴(kuò)增片段與SwaI內(nèi)切酶線性化過的pXK30-FLAG 30F質(zhì)粒利用同源重組酶重組，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。

用內(nèi)切酶PstI和XbaI線性化質(zhì)粒pBL001-30F-mruby2。利用相應(yīng)引物對(duì)質(zhì)粒pYTK-077擴(kuò)增得到不同截短長度啟動(dòng)子的KanMX表達(dá)盒片段，對(duì)質(zhì)粒pYTK-079擴(kuò)增得到不同截短長度啟動(dòng)子的HygB表達(dá)盒片段，將表達(dá)盒片段使用內(nèi)切酶PstI和XbaI酶切處理后，使用DNA連接酶連接線性化質(zhì)粒pBL001-30F-mruby2和表達(dá)盒片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證得到30F-mruby2-Kan系列和30F-mruby2-Hyg系列質(zhì)粒。

用內(nèi)切酶SbfI對(duì)pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS和pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS進(jìn)行線性化。利用相應(yīng)引物對(duì)質(zhì)粒pYTK-077擴(kuò)增得到不同截短長度啟動(dòng)子的KanMX表達(dá)盒片段，對(duì)質(zhì)粒pYTK-079擴(kuò)增得到不同截短長度啟動(dòng)子的HygB表達(dá)盒片段，將表達(dá)盒片段使用內(nèi)切酶SbfI酶切處理后，使用DNA連接酶連接線性化質(zhì)粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS和不同截短長度啟動(dòng)子的KanMX表達(dá)盒片段，不同截短長度啟動(dòng)子的HygB表達(dá)盒片段與線性化質(zhì)粒pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證得到06F-003-Kan系列質(zhì)粒和30F-004-Hyg系列質(zhì)粒。

1.5 mruby2熒光蛋白強(qiáng)度的測(cè)定

將質(zhì)粒pBL001-30F-mruby2、pXW06-FLAG 06F使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[16]轉(zhuǎn)化至BJ5464-NpgA，使用-Trp/-Ura雙缺缺陷型固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每個(gè)轉(zhuǎn)化從瓊脂培養(yǎng)基上挑取3個(gè)單克隆，使用24孔深孔板在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以2%轉(zhuǎn)接至含300 mg/L相應(yīng)抗生素的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸取10 μL發(fā)酵液加190 μL去離子水稀釋在酶標(biāo)板里，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600和熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為559 nm，發(fā)射波長為600 nm。

1.6 總DNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集約OD600=20的菌體至破碎管中，加入與細(xì)胞體積相當(dāng)?shù)乃嵝圆Ａ?，?00 μL STES(20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH=7.5)溶液，再加400 μL 酵母DNA提取試劑，劇烈振蕩10×30 s，每次間隔30 s，置于冰上。加入200 μL TE吹吸混勻，10 000 r/min離心5 min，溶液分4層，吸取最上層300 μL至1.5 mL離心管中，加入10%體積分?jǐn)?shù)的3.0 mol/L醋酸鈉，2倍體積無水乙醇，稍混勻，在-80 ℃靜置30 min后，10 000 r/min離心10 min棄上清液。加入500 μL無水乙醇洗滌，10 000 r/min離心5 min，棄盡上清液，55 ℃干燥DNA 20 min，加入40 μL TE(含RNase 20 μg/mL)，在55 ℃水浴30 min以消化RNA，得到無RNA雜質(zhì)的釀酒酵母總DNA。

得到上述的總DNA后，將其質(zhì)量濃度稀釋為100 ng/μL，用于qPCR分析。以染色體上的ALG9基因作為內(nèi)參基因，使用絕對(duì)定量法[17-18]分別測(cè)定目標(biāo)基因KanamycinR和HygromycinR的拷貝數(shù)與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 在釀酒酵母BJ5464-NpgA中合成10,11-dehydrocurvularin

將攜帶Aspergillusterreus來源的聚酮合酶基因片段的質(zhì)粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS轉(zhuǎn)化至BJ5464-NpgA[15]，每個(gè)轉(zhuǎn)化從瓊脂培養(yǎng)基上挑取3個(gè)單克隆，在多孔板接種2 mL合成培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min 搖床培養(yǎng)1 d。隨后以2%的接種量轉(zhuǎn)接至2 mL合成培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min 搖床培養(yǎng)2 d。

1.8 發(fā)酵產(chǎn)物的處理及HPLC檢測(cè)方法

使用鹽酸將發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)至5，在12 000 r/min 下離心10 min，用等體積的乙酸乙酯萃取上清液3次，取500 μL進(jìn)行真空離心濃縮，濃縮物使用100 μL甲醇溶解，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL。

HPLC分析程序：0～5 min流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為5%的乙腈和95%的0.1%乙酸溶液，5～15 min流動(dòng)相為乙腈在0.1%乙酸溶液的線性梯度為5%～95%，15～25 min流動(dòng)相為95%的乙腈和5%的0.1%乙酸溶液；流速為0.8 mL/min；島津inertsustain?C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測(cè)波長為300 nm[19]。

1.9 優(yōu)化10,11-dehydrocurvularin合成途徑以提高產(chǎn)量

將攜帶Aspergillusterreus來源的聚酮合酶基因片段且整合了抗生素抗性基因整合盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BJ5464-NpgA，每個(gè)轉(zhuǎn)化從瓊脂培養(yǎng)基上挑取3個(gè)單克隆，使用24孔深孔板在SC培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)配養(yǎng)，以2%接種量轉(zhuǎn)接至添加相應(yīng)抗生素的SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液的處理與產(chǎn)物檢測(cè)方法如上。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷抗生素抗性基因整合盒的構(gòu)建

將mruby2基因利用同源重組整合到pXK30-FLAG 30F得到質(zhì)粒pBL001-30F-mruby2，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，在質(zhì)粒pBL001-30F-mruby2基礎(chǔ)上構(gòu)建轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷抗生素抗性基因整合盒如圖1-a和圖1-b所示，將構(gòu)建的質(zhì)粒分別用XbaI和PstI酶切,結(jié)果如圖1-c和圖1-d所示，所的條帶大小與理論值相符，測(cè)序結(jié)果表明表達(dá)盒已成功構(gòu)建。

2.2 轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷抗生素抗性基因整合盒的mruby2表征

將帶有mruby2的整合盒里的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BJ5464-NpgA表達(dá)，在抗生素質(zhì)量濃度都為300 mg/L的YPD中發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，截短抗生素抗性基因的啟動(dòng)子會(huì)使得在同一個(gè)質(zhì)粒上的熒光蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)，且熒光蛋白的強(qiáng)度與啟動(dòng)子長度一定程度上呈負(fù)相關(guān)。

2.3 拷貝數(shù)絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)已報(bào)道的方法分別構(gòu)建2種基因標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的單拷貝質(zhì)粒。在KanamycinR基因和ALG9基因是單拷貝的質(zhì)粒中，KanamycinR基因和ALG9基因標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3-a，KanamycinR基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.221x+35.92(R2=0.996 3)，ALG9基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.329x+35.83(R2=0.995 9)；在HygromycinR基因和ALG9基因是單拷貝的質(zhì)粒中，HygromycinR基因和ALG9基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3-b，HygromycinR基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.267x+36.75(R2=0.996 0)，ALG9基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.344x+36.28(R2=0.994 2)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定質(zhì)?？截悢?shù)

按照方法1.6提取帶熒光蛋白的重組菌的總DNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定質(zhì)?？截悢?shù)，經(jīng)定量換算后的質(zhì)?？截悢?shù)結(jié)果如表3和表4所示。從結(jié)果中可以看出，通過截短抗生素抗性基因的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷使得其耐抗生素能力下降，細(xì)胞會(huì)通過增加質(zhì)?？截悢?shù)來維持一定水平的耐抗生素能力。在一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨著抗生素抗性基因啟動(dòng)子越短而增強(qiáng)，是因?yàn)闊晒獾鞍谆騧ruby2的拷貝數(shù)在增加。

表3 RT-PCR檢測(cè)KanMX整合盒質(zhì)?？截悢?shù)Table 3 RT-PCR to detect the plasmid copy number of truncated KanMX

表4 RT-PCR檢測(cè)HygB整合盒的質(zhì)?？截悢?shù)Table 4 RT-PCR to detect the plasmid copy number of truncated HygB

2.5 10,11-dehydrocurvularin的合成與檢測(cè)

帶有質(zhì)粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS的BJ5464-NpgA菌株與對(duì)照菌株在SC培養(yǎng)基發(fā)酵2 d的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC處理結(jié)果如圖4所示。在標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC結(jié)果對(duì)比下，表明10,11-dehydrocurvularin成功在釀酒酵母中合成。

2.6 使用優(yōu)化10,11-dehydrocurvularin合成途徑以提高產(chǎn)量

將分別攜帶1種轉(zhuǎn)錄缺陷表達(dá)盒與聚酮合酶的兩類質(zhì)粒進(jìn)行組合轉(zhuǎn)化至BJ5464-NpgA表達(dá)，共有5×5即25種組合。每個(gè)轉(zhuǎn)化挑取3個(gè)單克隆，使用24孔深孔板在SC培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1 d，以2%轉(zhuǎn)接含300 mg/L G418與300 mg/L潮霉素B的SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，經(jīng)上述處理方法后，測(cè)得其發(fā)酵產(chǎn)量如圖5所示。

在2種抗生素基因啟動(dòng)子完整的情況下，10,11-dehydrocurvularin產(chǎn)量為0.098 8 mg/L，在使用整合盒的情況下，產(chǎn)量最高的組合能使產(chǎn)量達(dá)到0.359 mg/L，是對(duì)照組即完整啟動(dòng)子組合的3.63倍。

3 結(jié)論與討論

已有報(bào)道質(zhì)?？截悢?shù)一定程度與目標(biāo)蛋白表達(dá)量成正相關(guān)[20]。本研究顯示出所使用的轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷抗生素抗性基因整合盒或許能夠作為一種提高質(zhì)?？截悢?shù)從而增強(qiáng)基因表達(dá)元件被開發(fā)[13]。其獨(dú)立性和通用性仍需從2個(gè)方面進(jìn)行考量：拷貝數(shù)的變化是否獨(dú)立于待表達(dá)基因、應(yīng)用到原核生物是否可行。即不同基因攜帶轉(zhuǎn)錄結(jié)合缺陷抗生素抗性基因整合盒是否具有相同的增強(qiáng)功能，在不同的宿主內(nèi)使用這種方法能否達(dá)到相同的效果。

異源表達(dá)生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品有很大的優(yōu)勢(shì)，以截短側(cè)耳素為例，截短側(cè)耳素是一種由擔(dān)子菌產(chǎn)生的抗生素，其在天然宿主中的產(chǎn)量不足以用于遺傳改造，但其在米曲霉中的異源表達(dá)使效價(jià)提高了2 000%，這使得這種重要抗生素首次可持續(xù)生產(chǎn)[6]。除了本文使用的調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)來優(yōu)化聚酮類化合物產(chǎn)量的方法，也有一些研究是通過優(yōu)化氧化代謝途徑提高產(chǎn)量[1]。氧化，是聚酮類化合物翻譯后修飾的重要步驟[3]，而大腸桿菌由于缺少一些后修飾功能，不是普適性的聚酮類化合物異源表達(dá)宿主[21]。

本課題在釀酒酵母中異源表達(dá)來自土曲霉的聚酮合酶合成10,11-dehydrocurvularin，并對(duì)該酶的代謝途徑進(jìn)行了優(yōu)化，提高產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，該表達(dá)盒在KanamycinR和HygromycinR基因啟動(dòng)子分別為完整長度和100 bp時(shí)異源合成10,11-dehydrocurvularin能獲得最大產(chǎn)量，最高產(chǎn)量約為0.359 mg/L。我們可以發(fā)現(xiàn)，并非合成酶基因拷貝越多，產(chǎn)量越高，發(fā)酵過程中合理的資源利用更有利于目的產(chǎn)物的合成。此研究將有利于今后非天然聚酮化合物的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化生產(chǎn)，隨著越來越多的聚酮類化合物的活性被挖掘出來，如何去大量獲取這些活性分子是不可缺少的研究方向。